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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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足下客

木虫 (正式写手)

[交流] 请教有关于双酶切后连接反应的有关问题

我现在要将一个2.8kb的PCR产物片段连接到一个约7kb大的质粒上(此质粒为自己构建的,是连接了4.3Kb基因的PMD19 T vector) 选用的酶切位点是salI和PstI,宝生物的酶,10*Tango buffer ,连接温度为14度,时间大约为12个小时。
可是我连接了两次都没有成功,不知道问题出在哪儿。希望虫友们指点一下,非常感谢!
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★
司马诸葛(金币+3,VIP+0):谢谢交流 8-17 10:19
首先确认是否酶切完全了,takara的内切酶非常糟糕,建议用NEB的,不会比takara的贵多少,关键是能够做出实验
同样ligase也是。我用的是TOYOBO的ligation high Ver2,16度 30min就完全连上了。
当然还有考虑你的Vector:Insert(摩尔比)
1:3~1:5是比较恰当的
2楼2008-11-28 09:59:44
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足下客

木虫 (正式写手)

怪不得呢,有时候双酶切都出来三条带,就是因为酶切不完全,出现了单酶切
我这次把连接温度换成了16度和4度,打算分别连接16小时和24小时。要是再连不上,我就要崩溃了
摩尔比不是在1:3——1:10之间吗?如果PCR产物加的太多会有什么影响呢?
3楼2008-11-28 10:29:48
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ningluztt

铜虫 (小有名气)


司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-17 10:19
链接时间不用那么长时间,4度过夜完全可以了。你用得是宝生物的酶,酶切之前看一下你使用的两个酶是否可以在同一buffer中酶切,如果两种酶不兼容,那就要分别酶切了。另外,你的酶切片段的量要适当。

适当增加PCR产物的量对你的连接有好处。
4楼2008-11-28 15:51:36
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liumikewolf

金虫 (小有名气)

我和你的情况大致相同,问题应该是出在了酶切连接上.我用的也是宝生物的酶.失败了n次了.如果你的问题解决了的话,别忘了一起分享一下成功的经验.
5楼2008-11-28 17:16:19
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liumikewolf

金虫 (小有名气)

我实验中,需要把5.3kb的双切,回收5.1kb的片段,但是切下来的200的小片段始终看不清楚,不知道是什么原因!你的情况呢?如果看不清小片段部分,是否就是酶切失败?
6楼2008-11-28 17:18:04
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

用NEB的酶就不会有失败的……
takara的酶每次都要做预实验,分别单切和双切看看是否完全
但NEB就可以免去这一步,绝对不会有任何问题
1:10有点夸张啦,其实我做得比较好的都是1:5,1:3差一些,更高的似乎有时候不稳定
7楼2008-11-28 17:30:11
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liumikewolf

金虫 (小有名气)

足下客  
最后试验结果如何?
8楼2008-12-04 18:08:44
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