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cafeytsao

新虫 (初入文坛)

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[交流] 关于白色念珠菌MLST，基因比对，提交等位基因等相关问题，谢谢！已有2人参与

各位老师好,，现在做基础得东西，所以很多都不太懂，临近毕业，实验不顺，很心慌，在做白色念珠菌得MLST时，我遇到了以下几个问题，所以想请教下各位，谢谢！

1.我在做ITS鉴定得时候，用的引物是IT4和ITS5，现测序结果回来，有几个标本340bpq前峰图都很好，但是340bp后就开始出现杂带（图1：)

还有两个标本提了两次DNA，结果回来都是有杂带(图2）,我想问下各位老师导致这些得原因是菌株没提纯，还是引物问题？因为我看到文献上大多都是ITS1和ITS4,而我用的ITS4和ITS5，对做MLST有没影响？。

2.上传序列到pubmlst比对时，需要将标准长度得那段序列剪切下来再比对吗？我都是直接比对的，比对得结果提示最接近匹配（closest match）等位基因编号，而不是完全符合（ exact match），请问closest match需要上传获得新的等位基因编号吗？（图 4）
3.如果上传等位基因，网站给了个excel模板，但我不是太明白，请看附件图片（图4）

4.我们在进行正反序列比对时，需要考虑兼并碱基得问题吗？还是按照峰图直接比对纠正就可以了？

本人在校研究生，明年毕业了，真的很心慌，希望各位老师指点，金币不足，还望见谅！谢谢！

图1.jpg

图2.jpg

图3.jpg

图4.jpg

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1楼 2016-10-22 20:45:00

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wh1925

新虫 (初入文坛)

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西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2016-10-27 22:13:45

我做的是细菌的mlst，所以没法回答你前面的两个问题，但是关于上传数据，我可以简单交流下。1.回来的序列需要进行拼接，然后上传的时候直接选择该拼接序列就可以了，这个可以在测序的时候要求公司给做。2.上传的时候如果不能直接找到等位基因号的，可以在上传的那个界面选择具体的基因再传，这样可以看到最相近的匹配，还可以知道你的序列中目标序列的起始位置，方便找到目标序列。这时候你先看看峰图看目标序列的位置有没有杂峰，对比正反向序列确保一致后，应该是一个新的等位基因，需要上传，或者再将那个样本的基因重测一次，如果还是找不到，那就是新的，需要上传。3.上传的时候序列必须只能是目标序列长度，把多余的要截掉，刚已经说了怎么找起始位置，然后根据前段长度就可以得到目标序列了。上传序列好像不需要用那个表格，只需把序列粘贴进去，然后把正反向序列和峰图都传上去作为支持文件，等管理员回信就好了。

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2楼2016-10-25 22:43:36

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cafeytsao

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引用回帖:

2楼: Originally posted by wh1925 at 2016-10-25 22:43:36
我做的是细菌的mlst，所以没法回答你前面的两个问题，但是关于上传数据，我可以简单交流下。1.回来的序列需要进行拼接，然后上传的时候直接选择该拼接序列就可以了，这个可以在测序的时候要求公司给做。2.上传的时候 ...

老师，您好，首先非常感谢您的回答，还有我想问下，你们测双向出来的结果，就算测序公司拼接好了，但是也需要正反序列的矫正啊，因为两条链，有些测出来的碱基不一致，那就需要看图，但是像那种两个波峰都挨在一起，波峰凸的不明显，或者是两个碱基波峰重叠，包括另外条链这个碱基位置也是同样的情况，你们要不要考虑兼并碱基？因为之前我看到一个天津医科大学的硕士论文都提到的兼并碱基，如图，不知道你们要不要将那个碱基纠正为以下兼并碱基如R(A/G),M(A/C),S(C/G)？