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新虫 (初入文坛)

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专业: 膜生物化学与膜生物物理学

[交流] 构建载体，出现奇葩现象！求大牛围观已有5人参与

最近构建质粒时，遇到一个令人费解的难题!具体情况如下：

   空载体为7300bp，目的片段为6000bp。由于担心无缝克隆对10Kb以上质粒的保真度，故直接采用双酶切连接方法（没有采用T载体）。最后得到菌落PCR阳性单克隆，之后摇菌送测序公司。测序结果：使用启动子CMV-F以及目的片段上测序引物都可以证实目的片段连入载体。

   令人费解的现象：因为实验要求需要中提，所以我使用测序正确的菌液进行扩大培养。但我中提出来的质粒确是空模版，再使用目的片段无法检测到信号！

   针对这些情况：

   1、挑单克隆失误：这种情况我已经排除，因为第一次出现过这样的情况后。我重新拿杂质粒（测序虽存在双峰，但正确的位置确是与我目的片段对应），重新使用公司DH-5a克隆菌进行转化。当挑完100个单克隆后，经菌落和测序鉴定到3个阳性单克隆，但我重新使用这些菌液进行中提仍未得到正确质粒。我现在弄不清是哪里出现问题，可不可以换感受态可以得到解决。

   2、实验技术方面：这些酶切位点选择都是经过考虑，实验方案应该是没有问题。与此同时，我还将同一载体但目的片段稍小的质粒构建成功，中提出来的质粒不存在任何问题。

   3、质粒不相容性：这种情况是不是可以用质粒不相容性来解释呢？即同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，同一启动子的质粒在细胞时，复制速率快的质粒会把复制速率慢的质粒淘汰掉。目前我只能用这个概念来解释这种现象了，毕竟最初多个测序结果完全正确。但最后中提后多次遇到目的质粒消失，提到空模板。

4、重头再连：当出现这样的现象后，我重新尝试再构载体。但是后面实验一直没能正确构上质粒，老是出现构上一段目的片段这样的情况。通过师兄指点现想到其他思路，将会继续重构。但是出现这样的现象无法解决的话，我还是担心后续的实验仍会重复这种现象

最近一直被构这个质粒所困扰，我跟师兄师姐以及外面公司都沟通过，但仍没有得到解决方案！

事关毕业大事，构质粒就耽误了这么久的时间！蓝瘦  香菇呀！

希望小木虫里的大牛能提供下指导！

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