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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶切连接不成功
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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饿的神啊

实习版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

[求助] 酶切连接不成功 已有1人参与

我想构建一个发夹结构用于RNAi，把长片段插入T载体(下游引物上有ClaI酶切位点），然后通过XhoI和ClaI双酶切短片段（上游引物加了XhoI，下游引物加ClaI）和长片段质粒，NEB的内切酶，酶切了一个小时，然后胶回收，用的promega T4连接酶连接，室温2h，然后转化，可是筛选出来的都只有长片段，没有短片段，说明连接没成功，是哪里的问题呢？
发夹结构是不是长片段用正向，短片段用反向插入的，不然接头对不上啊，但是没有成功？我怕自己搞错了方向，后来没有把短片段连T载体，直接把PCR产物胶回收后双酶切了，还是没有成功。我又把筛选的反向插入的长片段作为模板，扩增短片段，然后把PCR产物双酶切，可是还是不成功，到底是为什么啊

@youlinglyw @biostar2009 发自小木虫Android客户端
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1楼 2016-10-12 10:34:38
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Jessica0906

主管区长

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
您好，我想做植物的RNAi，请问如何选择RNAi片段呢？是ORF的随便300-500bp片段都可以么？
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11楼2017-06-14 16:40:48
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饿的神啊

版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
别沉啊，求指导啊！

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2楼2016-10-13 11:32:25
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star013

实习版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
我们公司可以做载体构建技术服务

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3楼2016-10-13 12:00:53
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bio转录组

管理员

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-10-13 22:47:51
饿的神啊: 金币+20, ★有帮助 2016-10-18 13:00:08
连接时间有点短吧，我们这T4连接的话都是过夜，你可以延长连接时间试一下。16°
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生活活生生累死
4楼2016-10-13 21:44:22
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