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求问“细胞生存率实验中抑制剂高浓度下生存率平台，但细胞没死完”的原因 已有1人参与
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想请教一个问题： 本人做改性蛋白质对特定细胞生长的抑制实验时(高浓度抑制生长)，发现高浓度下细胞生存率出现平台期，但总体抑制率都低于50%。数据是S型。 按道理说，高浓度的一个梯度下细胞生长有区别，但在数据里只体现为了平台期。实验是利用Celltiter blue测试的荧光值。 因为不好发图，就如下所示给出了大致曲线走势。纵轴荧光值。横轴蛋白质浓度。 ---------x x x-------------------------------------------100% x x x x x ---------------------------------------------------------- 0% |
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yyy0305
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
feiadafeng: 金币+10, ★有帮助 2016-09-12 14:51:48
感谢参与，应助指数 +1
feiadafeng: 金币+10, ★有帮助 2016-09-12 14:51:48
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做药物研发有5年多了，药物在高浓度出现平台期，有几个可能： 题主你的结论需要确定：细胞没死完，是通过在高浓度时通过信号进入平台期得出的，还是通过显微镜观察出来的？ 如果是通过显微镜观察得出的，很有可能是该蛋白药物对特定细胞的抑制作用只是有限的抑制作用，这个现象是存在的。 如果是通过信号进入平台期得出的，这个结论是有待商榷的，下面是高浓度时通过信号进入平台期的另一种解释： 荧光信号高浓度时进入平台期，这个荧光信号值是背景值，药物已经起到了100%的抑制作用，题主需要更改抑制率的计算公式。  荧光方法进行检测的原理是： 仪器提供一个特定波长的外源光激发荧光基团，荧光基团受到刺激后发射出另一个波长较激发光较大的发射光，该发射光被仪器捕捉到，转换为电信号值。 值得注意的是无论是激发波长，还是发射波长均是有一定的带宽，两个之间会有一定的重叠区域，也就是说仪器提供的发射光有一部分会被当做激发光捕捉到，这部分光就是背景值，演示图见附件  荧光光谱.jpg |
2楼2016-09-11 22:39:07
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首先感谢你的答复！ *是通过信号进入平台期确定的。这个100%细胞生存的荧光值是320000左右，背景(不含细胞的培养基)是170000左右，但是最高浓度的蛋白质加入后荧光值是260000左右。所以才会有上述问题。这个试剂是Promega提供的一种试剂，利用酶标仪测的560激发590发射，所以我认为不像共聚焦显微镜可能存在荧光信号串通道的问题。 *具体实验操作是5000细胞每孔接种的同时按梯度加入蛋白质溶液。培养46到72小时，加入celltiter blue试剂，孵育1小时后酶标仪测荧光。 *还有一个问题，请问前辈的药物研发主要涉及的是小分子还是有跟蛋白质相关？因为我感觉对于小分子药物来说，可能在特定高浓度下细胞生存率会骤减至0，但是对于蛋白质溶液来说，会不会出现高浓度并不会彻底杀死细胞？ |
3楼2016-09-12 14:50:30
yyy0305
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【答案】应助回帖
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feiadafeng: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-09-12 23:01:40
feiadafeng: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-09-12 23:01:40
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首先需要肯定的是你有自主的判断和作出假设的能力，不论最后结果怎么样，结果总会使人印象深刻的。我也是这么过来的。关于你后面的提问，我简单回答下： 我做3年的小分子药物筛选，1年多的抗体药物质量控制。关于celltiter blue，你可以找份说明书看看，国外的试剂有个好处，他们的试剂的说明书都比较详细全面，很多时候我觉得是在卖方法，说明书上有celltiter blue的核心成分氧化前后的激发和发射光谱，30nm的波长间隔不足以让仪器全面的屏蔽激发波长，同时celltiter blue的核心成分未被转换也可能提供一部分信号值，背景是肯定存在的。建议你的阴性背景设置为培养基+高浓度的蛋白药物，看看信号有没有变化趋势，高浓度的蛋白可能会贡献一部分信号值。 小分子药物如果用荧光检测也不会降到0，除非你用的是吸光度法如用MTT,CCK8之类的检测。小分子浓度过高，也有假阳性/假阴性的情况出现。如小分子有毒性（对所有细胞一致的杀伤作用），高浓度杀死细胞，这并不意味着该药物有效，这是假阳性。小分子类似于荧光基团，在560激发，590发射，细胞死光了，信号值依旧很高（假阴性）。 不论小分子还是大分子，都会存在部分有效地情况，不然也不会出现耐药性之类的问题了。眼见为实，无论什么检测方法都是间接的，多年的实验经历告诉我，信号会欺骗你，只是看骗到什么程度了。 |
4楼2016-09-12 19:34:38
5楼2016-09-12 23:01:52