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枯草芽孢杆菌质粒提取
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将两种质粒（p质粒 8kb左右 ，k质粒5kb左右）通过电转化的方法转入枯草芽孢杆菌WB800中，WB800含有CAM抗性，转化涂LB平板双抗性（25ug/ml kana+5ug /ml CAM），过夜培养，挑取单菌落（LB液体培养基含25ug/ml kana+5ug/ml CAM）提质粒，采用方法有三种 一、总DNA提取法，提取总DNA后转化大肠杆菌JM109，再提质粒，进行酶切 问题：转化后提取质粒条带仍然在12kb以上，怀疑是总DNA 疑问：是否是将质粒整合进了枯草芽孢杆菌的染色体上？ 曾经又一次在提取p质粒总DNA过程中，出来的条带有在12kb以上即总DNA的，还有在8k左右的，酶切后验证确实是p质粒，但是之后就再也没有这个条带了。酶切也不能切开。 由于转化进去的质粒均含有kana抗性，而且在平板和液体培养基中都正常生长，所以质粒应该是转进去了。 二、革兰氏阴性菌质粒提取试剂盒+溶菌酶 在溶液1加入后，加入20mg/ml溶菌酶40微升，其他步骤同普通试剂盒 问题：提取出来仍然均在12kb左右 三、一种适合芽孢杆菌质粒 DNA 提取的改良碱裂解法 溶液 Ⅰ : 含 50m mol/ L 的葡萄糖 , 25 mmol/ L Tris·Cl(pH 8 . 0) , 10 mmol/ L ED TA , 先配制各成份的母 液 , 葡萄糖过滤除菌 , 其余各成份常规灭菌 , 最后 , 无菌操作将各成份配成所需浓度 . 溶液 Ⅱ : 含 1 %SDS 和 0 . 2N N aOH , 先配制 2 %SDS 和 0 . 4N 的 NaOH 溶液 , N aO H 溶液常规灭菌 , 用之 前等体积混合 , 现用现配 . 溶液 Ⅲ: 5 mol/ L KAc 60ml , HAc 11 . 5ml , 水 28 . 5ml 配制成 100ml 的溶液 . 1 . 2 . 2 有关酶液 溶菌酶 : 10mg/ ml , 用无菌双蒸水配制 ; RNase A : 5m g/ ml , 用相应的 Buffer 配制 , 配成后 , 煮沸 10min 灭活 DN A 酶 . 1 . 3 改良碱裂解法 1 . 3 . 1 菌体培养 将试验菌株纯化后 , 接入含 20mlLB 培养基的小锥形瓶中 , 37 ℃ , 1 50rpm 振荡培养 10h 左右 . 1 . 3 . 2 质 粒 DNA 的提取 取 8ml 培养物至 15m l 的离心管中 , 4000rpm 离心 5 min , 弃尽上清 , 沉淀用 1ml S TE 溶液(0 . 1 mol/ L N aCl, 1 0 m mol/ L Tris·Cl(pH 8 . 0) , 1 mmol/ L ED TA(pH 8 . 0))充分悬浮 , 转入 1 . 5ml 离心管中 , 再用 STE 溶液洗菌体 1 -2 次 . 收集菌体后 , 加预冷的溶液 Ⅰ 150μl , 再加入 40μl 溶菌酶 , 5μlRN ase A , 充分悬浮菌体至 0 ℃40min . 再沿管壁加入 300μl 现配的溶液 Ⅱ , 轻颠倒离心管 3 -5 次 , 置 0 ℃4mi n 后 , 迅 速加入 200μl 溶液 Ⅲ, 0 ℃20min , 也可适当延长 . 1 2000rpm4 ℃离心 8min(也可室温离心 5min) . 上清转管加入 等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1) , 反复颠倒离心管数次 . 12000rpm 离心 5 min , 上清转管 , 加入等体积的 无水乙醇和 1/ 10 体积的 3M N aAc 溶液 , 室温沉淀至少 20min 或 4 ℃沉淀过夜 . 再 12000rpm 离心 5 - 8min , 弃上清 , 用 0 . 5 ml70 %乙醇洗沉淀1 - 2次 , 每次洗后用 微量加样器小 心吸去上清液 , 将 沉淀于3 7 ℃放置 问题：同上 很是苦恼，曾经不经意提取出来过，而且酶切验证正确，在抗性培养基中也能生长，但就是提取不出想要的质粒，请大家帮帮忙，分析一下，多谢！ |
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