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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 各位大神，小妹在此有问题请教
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一定考上研！

新虫 (初入文坛)

[求助] 各位大神，小妹在此有问题请教 已有4人参与

是这样，目前我在做克隆，出现了一个情况是转化后菌做PCR有目的片段，然而双酶切却没有目的片段，酶切我都是切过夜，这是为什么呢？请各位大神帮忙看看

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1楼 2016-08-12 22:42:38
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-13 06:47:02
最有可能原因是菌液PCR假阳性，现在酶切一般不需要过夜切，建议参照说明书切。
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2楼2016-08-12 22:56:17
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sweetcoffei

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能原因：1PCR为假阳性，2质粒DNA质量不够,3酶本身有问题(如失活),反应体系问题如最适反应缓冲液.这需要一个一个的排除,从而找出原因后解决.
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3楼2016-08-14 08:15:21
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sundan611

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR确实有可能是假阳性   你有没有把菌液拿去测序？一般测序正确的话在提质粒 然后双酶切
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4楼2016-08-15 15:33:22
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156348820

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

菌pcr完后培养，然后提质粒，然后pcr试过没？这个质粒浓度测过吗？酶切可设一个对照，如质粒中其他多位点的。分子实验出现问题只能一步步验证排除。要是都没问题，那只能休息一下换个人操作了。很正常……

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5楼2016-08-16 06:04:05
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