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一定考上研!

新虫 (初入文坛)

[求助] 各位大神,小妹在此有问题请教 已有4人参与

是这样,目前我在做克隆,出现了一个情况是转化后菌做PCR有目的片段,然而双酶切却没有目的片段,酶切我都是切过夜,这是为什么呢?请各位大神帮忙看看

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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-13 06:47:02
最有可能原因是菌液PCR假阳性,现在酶切一般不需要过夜切,建议参照说明书切。
2楼2016-08-12 22:56:17
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sweetcoffei

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可能原因:1PCR为假阳性,2质粒DNA质量不够,3酶本身有问题(如失活),反应体系问题如最适反应缓冲液.这需要一个一个的排除,从而找出原因后解决.
3楼2016-08-14 08:15:21
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sundan611

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PCR确实有可能是假阳性   你有没有把菌液拿去测序?一般测序正确的话在提质粒 然后双酶切
4楼2016-08-15 15:33:22
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156348820

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

菌pcr完后培养,然后提质粒,然后pcr试过没?这个质粒浓度测过吗?酶切可设一个对照,如质粒中其他多位点的。分子实验出现问题只能一步步验证排除。要是都没问题,那只能休息一下换个人操作了。很正常……

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5楼2016-08-16 06:04:05
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