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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物二次扩增需要稀释吗？
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remain2018

新虫 (正式写手)

[交流] PCR产物二次扩增需要稀释吗？ 已有2人参与

以某基因的5'和3'设计引物，以cDNA为模板PCR扩增后，想继续用该基因CDS序列设计的特异引物扩增该基因的话，第一步PCR产物需要稀释吗？后续步骤需要连接转化并测序

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1楼 2016-08-12 20:40:31
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
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remain2018: 金币+5 2016-08-12 22:22:00
关键看你首轮PCR产物浓度如何，一般，浓度低时可直接用原液，浓度高时可稀释100倍。
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2楼2016-08-12 20:52:35
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remain2018

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2016-08-12 20:52:35
关键看你首轮PCR产物浓度如何，一般，浓度低时可直接用原液，浓度高时可稀释100倍。

多少算高呀？什么浓度范围可以用原液啊？

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3楼2016-08-12 20:59:18
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by remain2018 at 2016-08-12 20:59:18
多少算高呀？什么浓度范围可以用原液啊？
...

首轮PCR产物没有跑电泳吗？能看到条带就算高。不需要考虑这么严格。
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4楼2016-08-12 21:08:59
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MMCCBB

新虫 (著名写手)
★ ★ ★
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remain2018: 金币+2 2016-08-12 22:22:57
电泳观察，当PCR产物浓度约20ng/ul时，不需要稀释，高的话就稀释到这个浓度。

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5楼2016-08-12 22:10:54
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remain2018

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by stone2239 at 2016-08-12 21:08:59
首轮PCR产物没有跑电泳吗？能看到条带就算高。不需要考虑这么严格。...

两对引物直接加入进行扩增可以吗

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6楼2016-08-12 22:16:31
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
remain2018: 金币+5 2016-08-12 23:01:51
引用回帖:
6楼: Originally posted by remain2018 at 2016-08-12 22:16:31
两对引物直接加入进行扩增可以吗
...

不建议这样扩，可能会出现四种条带，相差不大的话就连成一片了，而且会降低你目标带的数量，造成酶切产物不纯，从而影响连接效率。
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7楼2016-08-12 22:53:05
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匿名

用户注销 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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remain2018: 金币+5 2016-08-17 12:36:54
本帖仅楼主可见
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8楼2016-08-14 13:26:32
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choujiaoqi

铁杆木虫 (知名作家)
★ ★ ★
remain2018: 金币+3 2016-08-17 12:35:48
必须要稀释，不然的话容易出现扩增产物抑制效应，反而扩增不了
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9楼2016-08-14 15:48:08
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remain2018

新虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 大-木-虫 at 2016-08-14 13:26:32
其实我是这样建议你，一般你第一次扩增出来后直接连接载体测序，一般是连接普通的克隆载体，这样可以保证你第一次扩增结果的准确性，选择正确的克隆，提质粒，这样就可以当模版做后续实验用了，比如你构建表达载体， ...

谢谢

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10楼2016-08-17 12:35:02
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