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remain2018

新虫 (正式写手)

[交流] PCR产物二次扩增需要稀释吗? 已有2人参与

以某基因的5'和3'设计引物,以cDNA为模板PCR扩增后,想继续用该基因CDS序列设计的特异引物扩增该基因的话,第一步PCR产物需要稀释吗?后续步骤需要连接转化并测序

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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

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remain2018: 金币+5 2016-08-12 22:22:00
关键看你首轮PCR产物浓度如何,一般,浓度低时可直接用原液,浓度高时可稀释100倍。
2楼2016-08-12 20:52:35
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remain2018

新虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2016-08-12 20:52:35
关键看你首轮PCR产物浓度如何,一般,浓度低时可直接用原液,浓度高时可稀释100倍。

多少算高呀?什么浓度范围可以用原液啊?

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3楼2016-08-12 20:59:18
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by remain2018 at 2016-08-12 20:59:18
多少算高呀?什么浓度范围可以用原液啊?
...

首轮PCR产物没有跑电泳吗?能看到条带就算高。不需要考虑这么严格。
4楼2016-08-12 21:08:59
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MMCCBB

新虫 (著名写手)

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remain2018: 金币+2 2016-08-12 22:22:57
电泳观察,当PCR产物浓度约20ng/ul时,不需要稀释,高的话就稀释到这个浓度。

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5楼2016-08-12 22:10:54
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remain2018

新虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by stone2239 at 2016-08-12 21:08:59
首轮PCR产物没有跑电泳吗?能看到条带就算高。不需要考虑这么严格。...

两对引物直接加入进行扩增可以吗

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6楼2016-08-12 22:16:31
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

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remain2018: 金币+5 2016-08-12 23:01:51
引用回帖:
6楼: Originally posted by remain2018 at 2016-08-12 22:16:31
两对引物直接加入进行扩增可以吗
...

不建议这样扩,可能会出现四种条带,相差不大的话就连成一片了,而且会降低你目标带的数量,造成酶切产物不纯,从而影响连接效率。
7楼2016-08-12 22:53:05
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匿名

用户注销 (正式写手)

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remain2018: 金币+5 2016-08-17 12:36:54
本帖仅楼主可见
8楼2016-08-14 13:26:32
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choujiaoqi

铁杆木虫 (知名作家)

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remain2018: 金币+3 2016-08-17 12:35:48
必须要稀释,不然的话容易出现扩增产物抑制效应,反而扩增不了
9楼2016-08-14 15:48:08
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remain2018

新虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 大-木-虫 at 2016-08-14 13:26:32
其实我是这样建议你,一般你第一次扩增出来后直接连接载体测序,一般是连接普通的克隆载体,这样可以保证你第一次扩增结果的准确性,选择正确的克隆,提质粒,这样就可以当模版做后续实验用了,比如你构建表达载体, ...

谢谢

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10楼2016-08-17 12:35:02
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