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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 关于Cas9-sgRNA构建的困惑，质粒一直提不出来，向大家求助！！
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乌托小邦

木虫 (正式写手)

小虫虫

[求助] 关于Cas9-sgRNA构建的困惑，质粒一直提不出来，向大家求助！！

最近在试着做Cas9，想敲掉一个基因，选择了六个靶点。其中四个sgRNA很顺利就连进Cas9载体了，但是有两个靶点的sgRNA死活弄不出来，退火-连接-转化-挑斑-菌液PCR都没有问题（菌液PCR100%正确），然后我就抽提质粒送去测序。
1）测序公司告诉我质粒电泳没有条带，一片模糊；
2）我就自己也跑了电泳，确实永远都是一片模糊的；
3）然后我就怀疑是不是质粒抽提试剂盒坏了，我就直接拿菌液送去测序，测序公司（两家）也说抽提不出来质粒；
4）但是我拿菌液划线，是能正常长斑的；
5）抽提的质粒重新转化却啥也没长；
6）换了一家合成引物的公司，重新合成引物，结果依旧；
7）已经做了三次了，抽提试剂盒也换了新的，都是这样的，问题到底出在哪里呢？有这方面经验的大神能指点一下不？

我用的这个载体是14kb，是因为载体太大吗？如果是这个原因的话，为什么另外四个很顺利成功呢？
关于Cas9技术，我今年刚接触，不是太懂，异想天开一下：会不会是这两个靶点跟component cell里的某个基因匹配，cas9在component cell里发生切割作用了？（我也不知道这个时候Cas9是否能发挥作用，实在是想不出问题在哪，瞎猜的。。）

求帮助，求指点！
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凡事心中有数，人生难得糊涂。
1楼 2016-08-03 21:50:34
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不吃M的鱼

金虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-08-09 07:44:31
引用回帖:
6楼: Originally posted by 乌托小邦 at 2016-08-08 10:19:51
是的，在同一个载体上，px462...

说一下你的异想天开真的是异想天开了，首先:cas9是蛋白，你构建的质粒，这时cas9还不会表达呢;其次你连得靶点是不带pam序列的，cas9切割就是靠着你的靶点与基因组含pam序列的位点匹配后发生切割作用的。我也在做，不过我们的靶点和cas是分开合的。

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7楼2016-08-08 22:28:58
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yunsmile2016

新虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-04 11:05:45
最近也在作cas9，求交流

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2楼2016-08-03 23:13:55
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werq63

金虫 (著名写手)
你用的什么质粒呢？

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3楼2016-08-06 00:32:08
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不吃M的鱼

金虫 (小有名气)
你们cas9和sgRNA是构到一个载体上的？

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4楼2016-08-06 08:02:57
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乌托小邦

木虫 (正式写手)

小虫虫
引用回帖:
3楼: Originally posted by werq63 at 2016-08-06 00:32:08
你用的什么质粒呢？

px462
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凡事心中有数，人生难得糊涂。
5楼2016-08-08 10:19:24
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乌托小邦

木虫 (正式写手)

小虫虫
引用回帖:
4楼: Originally posted by 不吃M的鱼 at 2016-08-06 08:02:57
你们cas9和sgRNA是构到一个载体上的？

是的，在同一个载体上，px462
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凡事心中有数，人生难得糊涂。
6楼2016-08-08 10:19:51
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logan2012

金虫 (小有名气)
我们也是分开做,质粒和sgRNA是SIGMA公司提供的,用X-tremeGENE HP DNA Transfection  Rreagent一起转,目前进入下一步,求交流经验.
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小白一枚
8楼2016-08-12 17:41:31
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MMCCBB

新虫 (著名写手)
还别的感受态试试。鉴定用一个载体的和一个目的基因的

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9楼2016-08-12 22:39:31
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wenf98

木虫 (正式写手)
推荐到这里问问，人多力量大：CRISPR-Cas9腺病毒慢病毒 152408320
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10楼2016-08-13 16:14:39
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