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乌托小邦木虫 (正式写手)
小虫虫
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[求助]
关于Cas9-sgRNA构建的困惑，质粒一直提不出来，向大家求助！！
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最近在试着做Cas9，想敲掉一个基因，选择了六个靶点。其中四个sgRNA很顺利就连进Cas9载体了，但是有两个靶点的sgRNA死活弄不出来，退火-连接-转化-挑斑-菌液PCR都没有问题（菌液PCR100%正确），然后我就抽提质粒送去测序。 1）测序公司告诉我质粒电泳没有条带，一片模糊； 2）我就自己也跑了电泳，确实永远都是一片模糊的； 3）然后我就怀疑是不是质粒抽提试剂盒坏了，我就直接拿菌液送去测序，测序公司（两家）也说抽提不出来质粒； 4）但是我拿菌液划线，是能正常长斑的； 5）抽提的质粒重新转化却啥也没长； 6）换了一家合成引物的公司，重新合成引物，结果依旧； 7）已经做了三次了，抽提试剂盒也换了新的，都是这样的，问题到底出在哪里呢？有这方面经验的大神能指点一下不？ 我用的这个载体是14kb，是因为载体太大吗？如果是这个原因的话，为什么另外四个很顺利成功呢？ 关于Cas9技术，我今年刚接触，不是太懂，异想天开一下：会不会是这两个靶点跟component cell里的某个基因匹配，cas9在component cell里发生切割作用了？（我也不知道这个时候Cas9是否能发挥作用，实在是想不出问题在哪，瞎猜的。。） 求帮助，求指点！ |
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-08-09 07:44:31
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-08-09 07:44:31
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说一下你的异想天开真的是异想天开了，首先:cas9是蛋白，你构建的质粒，这时cas9还不会表达呢;其次你连得靶点是不带pam序列的，cas9切割就是靠着你的靶点与基因组含pam序列的位点匹配后发生切割作用的。我也在做，不过我们的靶点和cas是分开合的。 发自小木虫Android客户端 |
7楼2016-08-08 22:28:58
yunsmile2016
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