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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 新人求教，请问我想检测一个外源基因在酵母中的表达水平，应该准备些什么
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kaoyanjiu

新虫 (小有名气)

[求助] 新人求教，请问我想检测一个外源基因在酵母中的表达水平，应该准备些什么 已有1人参与

方法是不是用QRT-PCR呢？我看文献上说的采用这种方法，那我首先得提取RNA，反转为cDNA,然后做PCR，PCR的过程中就使用某某试剂盒带荧光信号的，然后检测PCR结果，以荧光值来反应mRNA的量。
1.原理是这样的吗？
2.文献中提到还得用管家基因作为参照对比，这又是为什么呢？
3.管家基因我也得自己选取，然后设计相应的PCR引物？
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1楼 2016-07-25 14:18:32
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-07-25 21:53:57
kaoyanjiu: 金币+10, ★★★很有帮助, 解决了我的三个疑问，谢谢。 2016-07-26 16:17:19
首先，我没做过外源基因表达水平的实验，我做的只是本身含有的基因表达量；
1.原理确实是这样的
2.荧光定量分为绝对定量和相对定量，一般相对定量简单一些，管家基因就是做相对定量用到的，管家基因相当于是内参，我用的是actin
3.管家基因看你用那种，有的需要自己去筛选
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
2楼2016-07-25 17:17:47
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kaoyanjiu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 曼陀罗的祈祷 at 2016-07-25 17:17:47
首先，我没做过外源基因表达水平的实验，我做的只是本身含有的基因表达量；
1.原理确实是这样的
2.荧光定量分为绝对定量和相对定量，一般相对定量简单一些，管家基因就是做相对定量用到的，管家基因相当于是内参， ...

你采用的内参基因是beita-actin吗
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3楼2016-07-26 16:20:06
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kaoyanjiu at 2016-07-26 16:20:06
你采用的内参基因是beita-actin吗...

对啊
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
4楼2016-07-26 18:48:06
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kaoyanjiu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 曼陀罗的祈祷 at 2016-07-26 18:48:06
对啊...

beta_actin在好多生物中都存在，我想问怎么在NCBI上毕赤酵母编码找到beta-actin的基因，我现在就是卡在这个上，然后根据这个基因设计引物是不能选择跨内含子的引物的吧？

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5楼2016-07-27 21:00:15
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by kaoyanjiu at 2016-07-27 21:00:15
beta_actin在好多生物中都存在，我想问怎么在NCBI上毕赤酵母编码找到beta-actin的基因，我现在就是卡在这个上，然后根据这个基因设计引物是不能选择跨内含子的引物的吧？
...

不好意思啊吗，这个不是很清楚，我用的就是别人筛选出来的
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kaoyanjiu
想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
6楼2016-07-27 21:04:59
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kaoyanjiu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 曼陀罗的祈祷 at 2016-07-27 21:04:59
不好意思啊吗，这个不是很清楚，我用的就是别人筛选出来的...

嗯呢。还是谢谢你了。

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7楼2016-07-28 10:26:55
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kaoyanjiu

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by 曼陀罗的祈祷 at 2016-07-27 21:04:59
不好意思啊吗，这个不是很清楚，我用的就是别人筛选出来的...

那能否把你的引物序提供我一看，blast一下就出来了，谢谢。

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8楼2016-07-30 00:13:13
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MeiPD

新虫 (小有名气)
我跟你一样，同求

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9楼2017-10-16 22:21:49
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