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1257851289新虫 (小有名气)
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[求助]
PCR没有目的条带，引物二聚体很明显 已有1人参与
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程序是95℃5min 95℃30s 60℃30s 72℃5min 32个循环 72℃延伸7min，目的条带4200bp，第一次很亮，后来带就不明显了，送原液测序不行，现在带都没了。求助该怎么改进 发自小木虫Android客户端 |
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houfuyuan
新虫 (小有名气)
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15楼2016-07-23 20:08:07
【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-08-12 22:32:55
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-08-12 22:32:55
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您好！PCR的问题向来号称最简单也最复杂。您这种情况，从您“第一次很亮”的描述来看，引物是匹配的，条件是可以的，后面重复实验扩不出来，则有可能是引物降解、模板降解、酶活失效等原因。个人认为模板降解的可能性最大。 但是如果“第一次很亮”是一种赝像，那您就需要仔细排查引物的设计，扩增条件的设定，模板的质量等所有体系因素了。通常的，换引物比较常见；扩增不出来时，降低退火温度到50℃也是可以尝试的；当然，模板的质量还是要讨论的，可以跑下胶，测下浓度什么的。通常酶失活的情况少见，但有条件的话，找一管阳性的酶试试，说不定有帮助呢。 总之，要设计对比实验对各种因素排查，有问题可以再交流。祝好运！ |
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12578512892楼2016-07-20 16:58:53
1257851289
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3楼2016-07-20 20:06:19
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