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[求助] IP问题求助，求高手解答已有1人参与

实验目的：富集HisTag目的蛋白
实验方法：
1. HisTag目的蛋白过表达质粒转染目标细胞
2. 采用CST hisTag磁珠进行IP、IgG作为对照
3. IP后磁珠用高盐洗脱液加loadingbuffer直接煮样
4. 样本进行SDS-Page 电泳
5. Page胶进行银染检测
实验结果：
左侧图片为银染结果，阴性对照和实验组都有很多条带并且两组之间无差异条带。右侧图片为western 结果。在His-Tag组中有His的条带，但IgG组也有一团模糊的信号，
Ip后上清western显示His-Tag IP后his明显减少，说明His IP 成功。
问题：
1. 如何减少IgG的非特异条带
2. 沉淀后没有发现目标蛋白的原因
3. 如何减少抗体的轻重链
4. 磁珠集合的蛋白抗体复合物如何洗脱比较合适

20160712 1.png

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1楼 2016-07-12 21:46:42

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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-07-15 07:25:11

首先有点不太明白，既然用的是His-tag磁珠，就是预先固定好His抗体的，你的IgG对照是怎么做的？按理IgG对照用的是没有偶联抗体的空白磁珠才有意义。最后WB检测用的一抗是抗His还是抗目的蛋白的特异性抗体？
沉淀后没有发现目的蛋白可能是过表达本身就没有表达或者表达量很低，所以WB检测应该加个Input作为阳性对照。
抗体的轻重链无法避免，但是在最后检测的时候可以通过选择不同种属的检测抗体，比如沉淀用的是His鼠单抗，最后WB检测时用His兔多抗，这样就不会产生轻重链的条带。
沉淀后的复合物一般直接加上样buffer煮就可以了