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liumikewolf

金虫 (小有名气)

[交流] T4连接酶无法连接pH8.0 tris盐酸缓冲液溶解的两个片段,为什么?!

T4连接酶无法连接pH8.0 tris盐酸缓冲液溶解的两个片段,为什么?!
具体方案是:
      片段1: 8.5微升
      片段2: 13微升
      buffer: 2.5微升
      T4: 1微升
   其中片段1,2均用pH8.0 tris盐酸缓冲液溶解.重复了三次均无法连接,这是什么原因? T4连接酶失活了吗? 还是体系中盐的浓度过高? 减少片段1,2的添加量,用水补足体积,降低盐浓度是否可行?
[search]T4连接酶[/search]
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liumikewolf

金虫 (小有名气)

我用的连接酶是宝生物的,说明书中并没有注明需要添加ATP,这是为什么?
5楼2008-11-10 14:45:45
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)

★ ★
lwf991229(金币+2,VIP+0):感谢参与讨论 ~~
你的两个片段是粘性末端还是平末端?如果是平末端的话连接起来比较难,要加ATP,以及延长连接时间.
2楼2008-11-10 10:58:12
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liumikewolf

金虫 (小有名气)

有一端是平末端.如果另外再加ATP的话,那个公司的产品比较好?另外体系内的终浓度应该是多少?
3楼2008-11-10 14:35:42
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

终浓度为5mM 我也在连接 祝好运
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2008-11-10 14:41:36
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