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liumikewolf

金虫 (小有名气)

[交流] T4连接酶无法连接pH8.0 tris盐酸缓冲液溶解的两个片段,为什么?!

T4连接酶无法连接pH8.0 tris盐酸缓冲液溶解的两个片段,为什么?!
具体方案是:
      片段1: 8.5微升
      片段2: 13微升
      buffer: 2.5微升
      T4: 1微升
   其中片段1,2均用pH8.0 tris盐酸缓冲液溶解.重复了三次均无法连接,这是什么原因? T4连接酶失活了吗? 还是体系中盐的浓度过高? 减少片段1,2的添加量,用水补足体积,降低盐浓度是否可行?
[search]T4连接酶[/search]
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)

★ ★
lwf991229(金币+2,VIP+0):感谢参与讨论 ~~
你的两个片段是粘性末端还是平末端?如果是平末端的话连接起来比较难,要加ATP,以及延长连接时间.
2楼2008-11-10 10:58:12
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liumikewolf

金虫 (小有名气)

有一端是平末端.如果另外再加ATP的话,那个公司的产品比较好?另外体系内的终浓度应该是多少?
3楼2008-11-10 14:35:42
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

终浓度为5mM 我也在连接 祝好运
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2008-11-10 14:41:36
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liumikewolf

金虫 (小有名气)

我用的连接酶是宝生物的,说明书中并没有注明需要添加ATP,这是为什么?
5楼2008-11-10 14:45:45
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liumikewolf

金虫 (小有名气)

另外在做化学转化时,连接产物不经纯化,直接转化感受态细胞,这样可以吗?虫友们快来帮助解答!
6楼2008-11-10 14:53:26
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liumikewolf

金虫 (小有名气)

brightfuture01  好运!共同努力!
7楼2008-11-10 14:54:41
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garon006

银虫 (正式写手)

原因较多,最验证下T4链接酶是否有问题?又何能失效。
8楼2008-11-10 16:16:37
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liumikewolf

金虫 (小有名气)

dingdingdingding顶
9楼2008-11-11 08:23:15
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户


amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流! 7-29 20:58
一端是平末端??什么意思??那另外一个呢?还有你的TrisHCl是多大浓度的?如果你的缓冲液浓度过大,那么连接酶的Buffer缓冲能力不能够影响到最终的连接体系,也就是不适合酶。还有连接的温度等等也要考虑
金币是赌出来的
10楼2008-11-11 08:36:01
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