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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » T4连接酶无法连接pH8.0 tris盐酸缓冲液溶解的两个片段,为什么?!
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liumikewolf

金虫 (小有名气)

[交流] T4连接酶无法连接pH8.0 tris盐酸缓冲液溶解的两个片段,为什么?!

T4连接酶无法连接pH8.0 tris盐酸缓冲液溶解的两个片段,为什么?!
具体方案是:
      片段1: 8.5微升
      片段2: 13微升
      buffer: 2.5微升
      T4: 1微升
   其中片段1,2均用pH8.0 tris盐酸缓冲液溶解.重复了三次均无法连接,这是什么原因? T4连接酶失活了吗? 还是体系中盐的浓度过高? 减少片段1,2的添加量,用水补足体积,降低盐浓度是否可行?
[search]T4连接酶[/search]
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1楼 2008-11-10 08:58:32
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
★ ★
lwf991229(金币+2,VIP+0):感谢参与讨论 ~~
你的两个片段是粘性末端还是平末端？如果是平末端的话连接起来比较难，要加ＡＴＰ，以及延长连接时间．
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2楼2008-11-10 10:58:12
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liumikewolf

金虫 (小有名气)
有一端是平末端.如果另外再加ATP的话，那个公司的产品比较好？另外体系内的终浓度应该是多少？
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3楼2008-11-10 14:35:42
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
终浓度为5mM 我也在连接 祝好运
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2008-11-10 14:41:36
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liumikewolf

金虫 (小有名气)
我用的连接酶是宝生物的,说明书中并没有注明需要添加ATP，这是为什么？
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5楼2008-11-10 14:45:45
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liumikewolf

金虫 (小有名气)
另外在做化学转化时,连接产物不经纯化,直接转化感受态细胞,这样可以吗?虫友们快来帮助解答!
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6楼2008-11-10 14:53:26
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liumikewolf

金虫 (小有名气)
brightfuture01  好运!共同努力!
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7楼2008-11-10 14:54:41
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garon006

银虫 (正式写手)
原因较多，最验证下T4链接酶是否有问题？又何能失效。
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8楼2008-11-10 16:16:37
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liumikewolf

金虫 (小有名气)
dingdingdingding顶
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9楼2008-11-11 08:23:15
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
★
amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 7-29 20:58
一端是平末端？？什么意思？？那另外一个呢？还有你的TrisHCl是多大浓度的？如果你的缓冲液浓度过大，那么连接酶的Buffer缓冲能力不能够影响到最终的连接体系，也就是不适合酶。还有连接的温度等等也要考虑
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金币是赌出来的
10楼2008-11-11 08:36:01
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