| 查看: 2804 | 回复: 0 | ||
[求助]
敲减目的基因却影响了另一个基因的表达/敲减目的基因的效率随着传代变差
|
|
各位好： 我 最近买了慢病毒来敲减一种基因，但是最后发现，阴性对照有问题。虽说我要敲减的目的基因在阴性对照内与wildtype并无差别，但是另一种我要研究的基因却只有wildtype的0.3，这样的影响是不能接受的。所以我想知道这可能是什么原因。 另一个问题是，我敲减的慢病毒序列，起初是有效的，但是后来发现敲减的效率变差了，也就是PCR做出来基因表达没有刚开始敲减后那么低了。我是一直保持10ug/ml的嘌呤霉素筛选浓度的，嘌呤霉素也没有问题，对于wildtype的细胞48h内可以全部杀死。 这两个问题实在是困扰我很久。这两个问题导致我完全无法继续试验，因为没有阴性对照，而且就算找公司另行合成，我也没有底气新的阴性对照就没有问题。对于第二个问题，我则是不知道是要重新用慢病毒来敲减还是重新合成比较好，亦或是当初我转染的时候出现了操作失误。 在这里附上我当时转染的操作： 1、细胞点六孔板。使之隔夜贴壁，汇合率大概30-50%。 2、弃旧培养基，换1ml新鲜完全培养金，并且加病毒液 30ul，polybrene 5ul。4小时后补加1ml完全培养基。24h后发现有绿色荧光（慢病毒带有绿色荧光序列）。48h后荧光几乎布满整个视野。 3、传代到一个小皿。隔夜贴壁，细胞大概在50-60%，此时换液，加嘌呤霉素10ug/ml。24h后几乎没有飘起死亡的细胞。 4、维持嘌呤霉素10ug/ml浓度，正常培养，传代和实验。 如果有谁有这方面的经验，或者建议，请不吝赐教。 |
回复此楼» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有108人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
