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敲减目的基因却影响了另一个基因的表达/敲减目的基因的效率随着传代变差
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各位好： 我 最近买了慢病毒来敲减一种基因，但是最后发现，阴性对照有问题。虽说我要敲减的目的基因在阴性对照内与wildtype并无差别，但是另一种我要研究的基因却只有wildtype的0.3，这样的影响是不能接受的。所以我想知道这可能是什么原因。 另一个问题是，我敲减的慢病毒序列，起初是有效的，但是后来发现敲减的效率变差了，也就是PCR做出来基因表达没有刚开始敲减后那么低了。我是一直保持10ug/ml的嘌呤霉素筛选浓度的，嘌呤霉素也没有问题，对于wildtype的细胞48h内可以全部杀死。 这两个问题实在是困扰我很久。这两个问题导致我完全无法继续试验，因为没有阴性对照，而且就算找公司另行合成，我也没有底气新的阴性对照就没有问题。对于第二个问题，我则是不知道是要重新用慢病毒来敲减还是重新合成比较好，亦或是当初我转染的时候出现了操作失误。 在这里附上我当时转染的操作： 1、细胞点六孔板。使之隔夜贴壁，汇合率大概30-50%。 2、弃旧培养基，换1ml新鲜完全培养金，并且加病毒液 30ul，polybrene 5ul。4小时后补加1ml完全培养基。24h后发现有绿色荧光（慢病毒带有绿色荧光序列）。48h后荧光几乎布满整个视野。 3、传代到一个小皿。隔夜贴壁，细胞大概在50-60%，此时换液，加嘌呤霉素10ug/ml。24h后几乎没有飘起死亡的细胞。 4、维持嘌呤霉素10ug/ml浓度，正常培养，传代和实验。 如果有谁有这方面的经验，或者建议，请不吝赐教。 |
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