| 查看: 2782 | 回复: 0 | ||
[求助]
敲减目的基因却影响了另一个基因的表达/敲减目的基因的效率随着传代变差
|
|
各位好： 我 最近买了慢病毒来敲减一种基因，但是最后发现，阴性对照有问题。虽说我要敲减的目的基因在阴性对照内与wildtype并无差别，但是另一种我要研究的基因却只有wildtype的0.3，这样的影响是不能接受的。所以我想知道这可能是什么原因。 另一个问题是，我敲减的慢病毒序列，起初是有效的，但是后来发现敲减的效率变差了，也就是PCR做出来基因表达没有刚开始敲减后那么低了。我是一直保持10ug/ml的嘌呤霉素筛选浓度的，嘌呤霉素也没有问题，对于wildtype的细胞48h内可以全部杀死。 这两个问题实在是困扰我很久。这两个问题导致我完全无法继续试验，因为没有阴性对照，而且就算找公司另行合成，我也没有底气新的阴性对照就没有问题。对于第二个问题，我则是不知道是要重新用慢病毒来敲减还是重新合成比较好，亦或是当初我转染的时候出现了操作失误。 在这里附上我当时转染的操作： 1、细胞点六孔板。使之隔夜贴壁，汇合率大概30-50%。 2、弃旧培养基，换1ml新鲜完全培养金，并且加病毒液 30ul，polybrene 5ul。4小时后补加1ml完全培养基。24h后发现有绿色荧光（慢病毒带有绿色荧光序列）。48h后荧光几乎布满整个视野。 3、传代到一个小皿。隔夜贴壁，细胞大概在50-60%，此时换液，加嘌呤霉素10ug/ml。24h后几乎没有飘起死亡的细胞。 4、维持嘌呤霉素10ug/ml浓度，正常培养，传代和实验。 如果有谁有这方面的经验，或者建议，请不吝赐教。 |
回复此楼» 猜你喜欢
替拉扎明为缺氧选择性细胞毒药物研究提供新思路
已经有0人回复
-
拉坦前列腺素(Latanoprost)：前列腺素F2α衍生物如何成为青光眼一线用药
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有110人回复
-
卟啉家族中的明星分子：MESO-四(3,5-二溴-4-羟基苯基)卟啉的性质与制备
已经有1人回复
-
宠物寄生虫防治：氟雷拉纳阻断GABA受体，持效12周驱杀跳蚤蜱虫
已经有0人回复
-
为呼吸打开通道：依伐卡托的科学之旅
已经有1人回复
-
Dordaviprone（ONC201）：小分子药物在中线胶质瘤中的应用
已经有0人回复
-
依喜替康：新型喜树碱衍生物的研究进展
已经有1人回复
-
膀胱癌靶向治疗新选择：厄达替尼作用机制与耐药研究进展
已经有0人回复
-
从水母到实验室：腔肠素的发现历程与生物发光奥秘
已经有1人回复
-
线粒体氧化磷酸化的新靶点：S-Gboxin的发现与研究进展
已经有0人回复
5