| 查看: 2842 | 回复: 0 | ||
[求助]
敲减目的基因却影响了另一个基因的表达/敲减目的基因的效率随着传代变差
|
|
各位好： 我 最近买了慢病毒来敲减一种基因，但是最后发现，阴性对照有问题。虽说我要敲减的目的基因在阴性对照内与wildtype并无差别，但是另一种我要研究的基因却只有wildtype的0.3，这样的影响是不能接受的。所以我想知道这可能是什么原因。 另一个问题是，我敲减的慢病毒序列，起初是有效的，但是后来发现敲减的效率变差了，也就是PCR做出来基因表达没有刚开始敲减后那么低了。我是一直保持10ug/ml的嘌呤霉素筛选浓度的，嘌呤霉素也没有问题，对于wildtype的细胞48h内可以全部杀死。 这两个问题实在是困扰我很久。这两个问题导致我完全无法继续试验，因为没有阴性对照，而且就算找公司另行合成，我也没有底气新的阴性对照就没有问题。对于第二个问题，我则是不知道是要重新用慢病毒来敲减还是重新合成比较好，亦或是当初我转染的时候出现了操作失误。 在这里附上我当时转染的操作： 1、细胞点六孔板。使之隔夜贴壁，汇合率大概30-50%。 2、弃旧培养基，换1ml新鲜完全培养金，并且加病毒液 30ul，polybrene 5ul。4小时后补加1ml完全培养基。24h后发现有绿色荧光（慢病毒带有绿色荧光序列）。48h后荧光几乎布满整个视野。 3、传代到一个小皿。隔夜贴壁，细胞大概在50-60%，此时换液，加嘌呤霉素10ug/ml。24h后几乎没有飘起死亡的细胞。 4、维持嘌呤霉素10ug/ml浓度，正常培养，传代和实验。 如果有谁有这方面的经验，或者建议，请不吝赐教。 |
回复此楼» 猜你喜欢
科研人必读：新一代 KRAS G12C 抑制剂 Olomorasib 的研究进展
已经有0人回复
-
BT-11（Omilancor）研究化合物全解析：从分子结构到实验应用要点
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有275人回复
-
富马酸贝达喹啉：二芳基喹啉类工具化合物的化学特征
已经有0人回复
-
BT投稿with editor状态快两周了，正常吗
已经有25人回复
-
Silevertinib（BDTX-1535）结构拆解：炔基双环片段为何成为合成瓶颈
已经有0人回复
-
RO4929097 解析：双苯并氮杂䓬骨架与 Notch 通路实验设计要点
已经有0人回复
-
分子量 1157 的 PROTAC 怎么配不析出：SGK3-PROTAC1 的溶解、分装与图谱复核
已经有0人回复
-
logP 6.1 的羧酸怎么配母液：GSK 650394 的溶解窗口与稀释顺序
已经有0人回复
-
从"水不溶"到 71 mg/mL：雷特格韦的 pH 依赖溶解与螯合色谱边界
已经有0人回复
-
133 Ų 的极性表面积，如何决定 TNG462 的母液配制与色谱条件
已经有0人回复
