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tw1123581321金虫 (小有名气)
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DH5a发酵罐表达 已有1人参与
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用DH5a表达一个蛋白，原始用2yt，然后换了半合成培养基：甘油，蛋白胨，酵母粉，磷酸盐，硫酸镁，微量元素等，在摇瓶水平上表达优于2yt 目前做发酵罐，底料同摇瓶，补料培养基：甘油，蛋白胨，酵母粉等。 具体流程：37度接种培养保持DO大于20，至DO大于80后，按μ0.2的速度指数流加6小时，1mMIPTG诱导，同时流加速度变为μ0.05，37度表达4小时，干重仅为15，表达量仅为摇瓶水平的1/3-1/4 请教 1怎样提高表达量？ 2DH5a一般能做到多大密度？用什么样的流加方式？ 发自小木虫Android客户端 |
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2楼2016-06-25 23:11:24
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5楼2016-06-27 09:59:38
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6楼2016-06-27 15:30:35
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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复制的别人的，基本上就是一些具有T7启动子的质粒不能在DH5里表达，理论上表达不出来。发酵工艺上基本上培养基中甘油的量要比摇瓶中大好多，菌在发酵罐中生长量要远远高于摇瓶中，另外你发酵罐中加抗生素了吗？不加抗生素容易质粒丢失。 DH5a和BL21都可以作为表达宿主。 BL21 是蛋白酶缺陷株，表达出来的蛋白不会被降解，做蛋白表达是比较适合用的，。 BL21生长要比DH5a快，这是他们的又一区别，在高密度发酵BL21表达蛋白时，需要控制它的表达条件，使得高密度且高表达。 DH5a复制稳定的特点，所以它是核酸疫苗通常使用的宿主株。 DH5a中表达时外源基因的启动子必须被大肠杆菌的RNA POLYMERASE 识别，比较好用的载体有PLPR可诱导的启动子。而带有T7 启动子的载体则不能在其中表达，因为识别T7 启动子的T7 RNA POLYMERASE 在DH5a中没有。 对于BL21，已将T7 RNA POLYMERASE 的编码基因整合到了菌的基因组上，能识别T7 启动子，从而可容纳外源基因在此T7启动子的带动下表达。 |
7楼2016-06-27 16:30:28
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