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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

[求助] GST蛋白纯化 已有2人参与

我三个蛋白,检测分别在上清和包涵体。
上清直接过GST柱子,结果跑胶什么都没有。
包涵体用曲拉通、脲变性、透析复性过之后,总有白色物质析出,过GST住之后跑胶也是什么都没有。
不知道主要出错在哪一步啊?
我的透析袋是14000的,目的蛋白50000的。
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by hc-material at 2016-06-20 11:09:24
透析复性时出现的沉淀,是不是目的蛋白?复性后标签都包裹住了,过GST有何意义、建议变性情况下纯化,过GST柱,然后纯化后,在想办法复性。祝顺利

透析后,离心,上清和沉淀都检测出目的蛋白。
而且上清过柱子以后检测却没有目的蛋白。
是不是没有洗脱下来?我用的谷胱甘肽和elution

发自小木虫Android客户端
3楼2016-06-20 16:19:10
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

透析复性时出现的沉淀,是不是目的蛋白?复性后标签都包裹住了,过GST有何意义、建议变性情况下纯化,过GST柱,然后纯化后,在想办法复性。祝顺利
2楼2016-06-20 11:09:24
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walking dead

金虫 (小有名气)

填料制备和蛋白纯化专家


【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2016-06-20 16:19:10
透析后,离心,上清和沉淀都检测出目的蛋白。
而且上清过柱子以后检测却没有目的蛋白。
是不是没有洗脱下来?我用的谷胱甘肽和elution
...

既然离心后检测出蛋白了,初步推测是纯化过程中的问题。你过柱子用的缓冲液是什么,PH多少,配制有无问题,纯化过程中操作温度是否适宜。给你推荐个缓冲液体系。你试试。平衡(洗涤液)50mM  Tris-Hcl(PH=8.3)的配制:0.1M  Tris溶液50ml,加0.1M  盐酸20ml  0.9g Nacl,加水至100ml;(这里面加盐是为了避免离子作用吸附)
洗脱液  50mM Tris-Hcl+还原型谷胱甘肽(PH=8.3)的配制:0.1M  Tris溶液50ml,0.614g还原型谷胱甘肽,然后用0.1M  盐酸调PH=8.3,加水到100ml。
注意:还原型谷胱甘肽容易氧化,需随配随用,所以缓冲液不要配的太多,根据自己情况配。
忘顺利。
4楼2016-06-23 15:11:44
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

我是直接买的和柱子配套的洗脱液和平衡液 @hc-material

发自小木虫Android客户端
5楼2016-06-23 16:28:13
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