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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » GST蛋白纯化
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

[求助] GST蛋白纯化 已有2人参与

我三个蛋白，检测分别在上清和包涵体。
上清直接过GST柱子，结果跑胶什么都没有。
包涵体用曲拉通、脲变性、透析复性过之后，总有白色物质析出，过GST住之后跑胶也是什么都没有。
不知道主要出错在哪一步啊？
我的透析袋是14000的，目的蛋白50000的。
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1楼 2016-06-16 20:56:24
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

透析复性时出现的沉淀，是不是目的蛋白？复性后标签都包裹住了，过GST有何意义、建议变性情况下纯化，过GST柱，然后纯化后，在想办法复性。祝顺利
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2楼2016-06-20 11:09:24
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hc-material at 2016-06-20 11:09:24
透析复性时出现的沉淀，是不是目的蛋白？复性后标签都包裹住了，过GST有何意义、建议变性情况下纯化，过GST柱，然后纯化后，在想办法复性。祝顺利

透析后，离心，上清和沉淀都检测出目的蛋白。
而且上清过柱子以后检测却没有目的蛋白。
是不是没有洗脱下来？我用的谷胱甘肽和elution

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3楼2016-06-20 16:19:10
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walking dead

金虫 (小有名气)

填料制备和蛋白纯化专家

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2016-06-20 16:19:10
透析后，离心，上清和沉淀都检测出目的蛋白。
而且上清过柱子以后检测却没有目的蛋白。
是不是没有洗脱下来？我用的谷胱甘肽和elution
...

既然离心后检测出蛋白了，初步推测是纯化过程中的问题。你过柱子用的缓冲液是什么，PH多少，配制有无问题，纯化过程中操作温度是否适宜。给你推荐个缓冲液体系。你试试。平衡（洗涤液）50mM  Tris-Hcl（PH=8.3）的配制：0.1M  Tris溶液50ml，加0.1M  盐酸20ml  0.9g Nacl，加水至100ml；（这里面加盐是为了避免离子作用吸附）
洗脱液  50mM Tris-Hcl+还原型谷胱甘肽（PH=8.3）的配制：0.1M  Tris溶液50ml，0.614g还原型谷胱甘肽，然后用0.1M  盐酸调PH=8.3，加水到100ml。
注意：还原型谷胱甘肽容易氧化，需随配随用，所以缓冲液不要配的太多，根据自己情况配。
忘顺利。
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4楼2016-06-23 15:11:44
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
我是直接买的和柱子配套的洗脱液和平衡液 @hc-material

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5楼2016-06-23 16:28:13
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hc-material

专家顾问 (职业作家)
明白了，你买的试剂盒，可以楼上建议的试试，祝顺利

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6楼2016-06-23 21:53:56
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