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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助：基因全长扩增，后半段扩增出来了，前半段没有扩增出来。什么原因？
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guosuccess

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助：基因全长扩增，后半段扩增出来了，前半段没有扩增出来。什么原因？

最近在扩增全长时，出现很怪的现象。希望大家指导一二：
1. 全长大约3.5kb。 扩增全长时，没有条带，换过Taq酶以及Pfu酶，模板换过肺癌细胞、肺正常组织、黑色瘤细胞等等。touch-down也做过。都没有条带。按文献报道，该基因在肺癌中存在着高表达。不知道什么原因？
2. 基于上面的现象，我把基因切断（中间正好有一个单一的限制性内切酶位点），分成两部分，分别扩增。结果下游部分顺利扩增出来，上游部分却没扩出来。不知道什么原因？
对了，扩增上游部分时，更换过下游引物，就是不出来。

麻烦大家帮吗分析分析。着急啊。
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1楼 2016-06-12 11:01:17
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guosuccess

新虫 (初入文坛)
哪位大神帮帮忙吧。
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2楼2016-06-13 10:54:03
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苏莫离

新虫 (初入文坛)
Pfu酶的dNTP里貌似不能有dutp还是什么来着（记不住了），否则DNA合成会终止，你仔细看看说明书吧

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3楼2016-06-13 16:06:35
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wochong

新虫 (小有名气)
应该是引物的原因，你下游出来了上游没出来，，酶什么的应该是没有问题的，扩增的时候没有对照组么？
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4楼2016-06-15 16:44:00
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guosuccess

新虫 (初入文坛)
需要拉全长，上游引物已固定，下游引物也换过。依然出不来。
郁闷ing！
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5楼2016-06-21 12:16:20
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