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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增
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zhangxf2014

新虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增 已有4人参与

请教: 最近在做PCR扩增，进行PCR产物胶回收，电泳检测结果没有条带，这是什么原因造成的？之后做连接转化(均按说明书进行)，菌液检测都是空载，请大家帮忙分析下，哪里出问题了？谢谢！

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1楼 2016-06-12 08:22:23
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Bioexperixgs

新虫 (正式写手)
没条带竟然还有胆量继续往下做，佩服楼主

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10楼2016-06-14 23:13:34
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普通回帖

寂寞之巅

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 分子生物版块鼓励您发帖积极交流，myprayer祝您科研顺利，文章多多。 2016-06-12 17:43:53
不是应该先确认你的PCR反应体系，PCR程序是不是正确的吗？PCR完成后跑个胶看有没有目的条带再做后续实验吧
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好好学习，天天向上
2楼2016-06-12 09:55:42
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。祝您科研顺利，文章多多。 2016-06-12 17:44:12
首先你回收完片段检测不到，进行转化出现空载也就很正常了，另外进行pcr后，回收前，目的条带的特异性，浓度怎么样呢？你需要确定是pcr问题还是回收的问题，祝好。

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
3楼2016-06-12 12:08:36
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zhangxf2014

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-06-12 12:08:36
首先你回收完片段检测不到，进行转化出现空载也就很正常了，另外进行pcr后，回收前，目的条带的特异性，浓度怎么样呢？你需要确定是pcr问题还是回收的问题，祝好。
...

PCR产物的大小为500bp左右，单一条带。回收后测的浓度是15.2ng/ul 。但是电泳跑不出条带，是回收的问题么？

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4楼2016-06-12 17:04:06
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ssswzf

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangxf2014 at 2016-06-12 17:04:06
PCR产物的大小为500bp左右，单一条带。回收后测的浓度是15.2ng/ul 。但是电泳跑不出条带，是回收的问题么？
...

pcr产物回收率用超微量测试是不准确的，胶回收一般用的是高序列盐，很难去除干净的，会影响你的检测结果，最可靠的办法是用电泳检测，按照你说的PCR产物500bp，条带单一的话也可以不用进行胶回收实验的哦，你可以直接通过pcr产物纯化试剂盒来做，简单快捷，而且用pcr产物纯化以后你可以用超微量来检测（非高序列盐），磁珠法pcr产物纯化试剂可以在15min内完成实验，不需要离心机，回收率最高可达95%左右，
可以联系Q 619857031，具体沟通一下，郑州英诺生物科技有限公司
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5楼2016-06-13 12:59:38
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504775490

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
pcr后电泳条带单一的话说明PCR这一步没有问题，如果后续只是克隆到载体用于模板扩增的话可以选择试剂盒，用pcr产物和Buffer直接连接到克隆的T载体上，不需要酶切，直接测序就好。如果是用于表达构建的，很可能问题出现做你胶回收这步，一般情况下用试剂盒是不太会出问题的，你检查一下盒子里的东西有没有问题，柱子是不是完好，祝实验顺利
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6楼2016-06-13 14:38:58
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wellsunshine

新虫 (初入文坛)
PCR有几处容易出问题，比如，引物设计，设计不好很容易产生引物二聚体，电泳结果是单一条带。还有，回收是怎么做的，我们这边一般是用试剂盒，结果一般没什么问题。

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7楼2016-06-13 15:26:34
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vjebejw570
祝福
8楼2016-06-13 16:29:07
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zhangxf2014

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 504775490 at 2016-06-13 14:38:58
pcr后电泳条带单一的话说明PCR这一步没有问题，如果后续只是克隆到载体用于模板扩增的话可以选择试剂盒，用pcr产物和Buffer直接连接到克隆的T载体上，不需要酶切，直接测序就好。如果是用于表达构建的，很可能问题出 ...

谢谢

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9楼2016-06-13 21:22:41
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