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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 表达载体
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yuan720222

新虫 (初入文坛)

[求助] 表达载体 已有2人参与

目的片段插入到双元表达载体中，经过转化后，在抗氯霉素的培养基中不能长斑，已经做了很长时间了，不知道大神们有没有遇到过这种现象，我的目的片段为5000bp，载体片段为11000bp,是不是因为片段过大，不容易连接成功？我用的T4酶进行连接的。
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1楼 2016-06-04 16:21:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用于克隆的空载体对氯霉素的抗性如何？还是说目的片段才带有氯霉素抗性？
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为什么
3楼2016-06-04 17:56:54
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普通回帖

gin_starwind

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-04 22:03:51
片段确实大了点，不好连。有必要的话换个感受态菌种试试，或考虑利用同源重组。

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2楼2016-06-04 17:38:44
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15113546664

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-06 19:48:18
请问内切酶切的时候位点有没有搞错，或者只用一种酶切，环化的可能性很高，空载体，也可能是目的基因的确太大了，换个载体，看看是表达载体还是克隆载体，

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4楼2016-06-05 00:11:18
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yuan720222

新虫 (初入文坛)
内容已删除
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5楼2016-06-05 08:02:52
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yuan720222

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 547star at 2016-06-04 17:56:54
用于克隆的空载体对氯霉素的抗性如何？还是说目的片段才带有氯霉素抗性？

我的载体抗氯霉素
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6楼2016-06-05 08:03:27
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yuan720222

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gin_starwind at 2016-06-04 17:38:44
片段确实大了点，不好连。有必要的话换个感受态菌种试试，或考虑利用同源重组。

我们用的是DH5@
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7楼2016-06-05 08:06:19
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maixiaodaou

新虫 (小有名气)
片段有点长，是过夜连的吗？还有就是感受态的问题

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8楼2016-06-05 09:33:43
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gin_starwind

新虫 (初入文坛)
先连接过夜试试，不行的话，感受态菌有条件试试DH10B。

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9楼2016-06-05 11:56:01
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221345

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-06 19:48:48
可以先连接克隆载体，再连入表达载体，这样比直连表达会容易一些，我做过8K的，阳性菌斑特少，可是就是想要的，试试吧
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10楼2016-06-05 21:06:29
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