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yuan720222

新虫 (初入文坛)

[求助] 表达载体 已有2人参与

目的片段插入到双元表达载体中,经过转化后,在抗氯霉素的培养基中不能长斑,已经做了很长时间了,不知道大神们有没有遇到过这种现象,我的目的片段为5000bp,载体片段为11000bp,是不是因为片段过大,不容易连接成功?我用的T4酶进行连接的。
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
用于克隆的空载体对氯霉素的抗性如何?还是说目的片段才带有氯霉素抗性?
为什么
3楼2016-06-04 17:56:54
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普通回帖

gin_starwind

新虫 (初入文坛)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-04 22:03:51
片段确实大了点,不好连。有必要的话换个感受态菌种试试,或考虑利用同源重组。

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2楼2016-06-04 17:38:44
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15113546664

新虫 (初入文坛)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-06 19:48:18
请问内切酶切的时候位点有没有搞错,或者只用一种酶切,环化的可能性很高,空载体,也可能是目的基因的确太大了,换个载体,看看是表达载体还是克隆载体,

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4楼2016-06-05 00:11:18
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yuan720222

新虫 (初入文坛)

内容已删除
5楼2016-06-05 08:02:52
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yuan720222

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 547star at 2016-06-04 17:56:54
用于克隆的空载体对氯霉素的抗性如何?还是说目的片段才带有氯霉素抗性?

我的载体抗氯霉素
6楼2016-06-05 08:03:27
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yuan720222

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gin_starwind at 2016-06-04 17:38:44
片段确实大了点,不好连。有必要的话换个感受态菌种试试,或考虑利用同源重组。

我们用的是DH5@
7楼2016-06-05 08:06:19
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maixiaodaou

新虫 (小有名气)

片段有点长,是过夜连的吗?还有就是感受态的问题

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8楼2016-06-05 09:33:43
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gin_starwind

新虫 (初入文坛)

先连接过夜试试,不行的话,感受态菌有条件试试DH10B。

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9楼2016-06-05 11:56:01
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221345

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-06 19:48:48
可以先连接克隆载体,再连入表达载体,这样比直连表达会容易一些,我做过8K的,阳性菌斑特少,可是就是想要的,试试吧
10楼2016-06-05 21:06:29
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