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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 蛋白质纯化
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
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10楼: Originally posted by baima at 2016-06-03 17:06:41
你是梯度透析吗？比如说，我纯化的蛋白样品是含8M尿素，我先用4M尿素的透析液，再换2M，再换1M，最后0M。复性过程切记不要过快，而且最好低温进行。我们一般都是在4度搅拌透析的
...

我跟你的正好相反哎，我是0, 2M, 4M, 8M。分别收集沉淀，沉淀，沉淀，上清。
4度透析16h以上，换一次新透析液，再透析16h以上。  
就是透析之后，好多白色絮状物质，离心我检测了这些东西是蛋白。上清过柱子之后检测什么也没有
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11楼2016-06-03 17:13:04
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baima

新虫 (小有名气)
★
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11楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2016-06-03 17:13:04
我跟你的正好相反哎，我是0, 2M, 4M, 8M。分别收集沉淀，沉淀，沉淀，上清。
4度透析16h以上，换一次新透析液，再透析16h以上。  
就是透析之后，好多白色絮状物质，离心我检测了这些东西是蛋白。上清过柱子之后 ...

过纯化柱之前为什么要梯度透析呢？我都是直接用8M变性裂解液溶解裂解沉淀，，上清用来蛋白纯化，收集含目的蛋白的洗脱峰用于后续梯度透析。。。。

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在压力中坚持，在逆境中进步！
12楼2016-06-03 18:36:09
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
学习

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13楼2016-06-03 23:50:08
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XMC-7

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
11楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2016-06-03 17:13:04
我跟你的正好相反哎，我是0, 2M, 4M, 8M。分别收集沉淀，沉淀，沉淀，上清。
4度透析16h以上，换一次新透析液，再透析16h以上。  
就是透析之后，好多白色絮状物质，离心我检测了这些东西是蛋白。上清过柱子之后 ...

能否把完整的方法发出来？
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能帮的帮，难事求助的心情咱也经历过
14楼2016-06-06 15:40:37
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swkwjf40

金虫 (正式写手)
★
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纯化过程需要磁珠的可以联系我们哦

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15楼2016-06-07 06:43:29
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
[quote]12楼: Originally posted by baima at 2016-06-03 18:36:09
过纯化柱之前为什么要梯度透析呢？我都是直接用8M变性裂解液溶解裂解沉淀，，上清用来蛋白纯化，收集含目的蛋白的洗脱峰用于后续梯度透析。。。。
... [/quote
不好意思，我理解错你了。我也是用8M的脲溶解包涵体，然后透析的，你的意思是这里你用的是梯度对吧？我是直接放在0M的脲里面透析两次的，出来就全部成絮状沉淀了。是不是浓度差太大了造成的这个原因。
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16楼2016-06-13 09:13:54
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by baima at 2016-06-03 18:36:09
过纯化柱之前为什么要梯度透析呢？我都是直接用8M变性裂解液溶解裂解沉淀，，上清用来蛋白纯化，收集含目的蛋白的洗脱峰用于后续梯度透析。。。。
...

你就是这样做出来的是吧？我也试试梯度透析的方法
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17楼2016-06-13 11:31:04
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by XMC-7 at 2016-06-06 15:40:37
能否把完整的方法发出来？...

就是变形和复性这两个过程，变性就很简单了，高浓度的脲或者盐酸胍变性。
复性就有些麻烦，我暂时没有复性成功的
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18楼2016-06-13 11:32:27
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
其实我的上清里面也有目的蛋白条带，只是我收集上清过柱子纯化后，跑胶什么都没有了？
这是什么愿意呢？含量太低了？
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19楼2016-06-15 12:18:56
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baima

新虫 (小有名气)
★
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16楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2016-06-13 09:13:54
12楼: Originally posted by baima at 2016-06-03 18:36:09
过纯化柱之前为什么要梯度透析呢？我都是直接用8M变性裂解液溶解裂解沉淀，，上清用来蛋白纯化，收集含目的蛋白的洗脱峰用于后续梯度透析。。。。
...  ...

很有可能啊，梯度跨度太大了。过完镍柱的洗脱峰，我用梯度透析，成功率还是很高的

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在压力中坚持，在逆境中进步！
20楼2016-06-16 08:21:30
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