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darlingbear

新虫 (小有名气)

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[求助] 小分子蛋白（约14kD）,需要在跑胶和转膜上注意些什么已有1人参与

跑这种小分子蛋白对running buffer或trans buffer有没有什么特殊的要求

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1楼 2016-05-24 12:12:23

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沉默、颜泪

木虫 (正式写手)

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电泳能做出来吧？染色后能看到目的条带吗？做WB要注意上样量，上样蛋白最好控制在20——40ug之间，转膜一般用湿转，14KD的蛋白用0.22um的膜、180mA，30分钟即可。全程注意控温，冰水浴转膜。封闭1——2h，一抗孵育最为关键！一抗的好坏直接影响最终结果。一般4℃孵育过夜，第二天多次清洗，二抗推荐用1:10000倍稀释（影响背景值）。 WB最重要的就是一抗，其他步骤注意一下都挺好规范的。

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