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pissor

木虫 (正式写手)

[求助] 付金币紧急求助:为什么菌落PCR是阳性,但酶切后为空载体大小?

    载体是原核表达载体pet28a,大小为5369bp,目的基因大小为750bp,二者用相同的两个内切酶酶切后,连接,转化大肠杆菌TOP 10,在长出菌落后,随机挑取做菌落PCR,可以扩出和目的基因一样大小的条带,选取可以扩出目的带的菌落(在做菌落PCR时已经做相应的划线培养),提取质粒后,做单酶切后竟然是是空载体的大小,当然了,双酶切也没有切出750bp大小的条带。
       请教大虾指点,这是什么原因?如何解决?
       谢谢您的帮助!
游离在生存的边缘上,踯躅在科学的门外,溺死在知识的海洋中,转世在报恩的篱下。
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chjw2010

铁杆木虫 (著名写手)

项目经理

不清楚,替你顶一下
新的一年!
4楼2008-11-01 19:31:07
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pissor

木虫 (正式写手)

只要虫友能分析出原因或者给出解决方法,均可获得金币!

若您提出的解决方法经过我的实验验证有效,您将获得最多的金币!

有效期至直至验证正确!
游离在生存的边缘上,踯躅在科学的门外,溺死在知识的海洋中,转世在报恩的篱下。
2楼2008-11-01 16:49:42
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lifei-fei

金虫 (著名写手)

伊丽莎白

恩,实验室的人也出现过这种情况,没有连上,只是形成假环,提质粒时就带上了,PCR可以检测出。要连的片段不是按照设计的酶切位点连上去的,是通过其它方式暂时连上去的,形成一种成为假环的东西,是不能酶切的!继续重新构建吧!祝你好运!
做有意义的事就是好好活着!
3楼2008-11-01 19:06:35
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pissor

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by lifei-fei at 11/1/08  19:06:
恩,实验室的人也出现过这种情况,没有连上,只是形成假环,提质粒时就带上了,PCR可以检测出。要连的片段不是按照设计的酶切位点连上去的,是通过其它方式暂时连上去的,形成一种成为假环的东西,是不能酶切的! ...

继续从头做?没有其他的办法吗?你们实验室是怎么最终构建好表达载体的?靠次数、凭概率?
游离在生存的边缘上,踯躅在科学的门外,溺死在知识的海洋中,转世在报恩的篱下。
5楼2008-11-01 19:39:30
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