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小木虫论坛-学术科研互动平台» 网络生活区» 有奖问答 » 有奖问答中转子版 » 付金币紧急求助：为什么菌落PCR是阳性，但酶切后为空载体大小？
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pissor

木虫 (正式写手)

[求助] 付金币紧急求助：为什么菌落PCR是阳性，但酶切后为空载体大小？

    载体是原核表达载体pet28a,大小为5369bp，目的基因大小为750bp,二者用相同的两个内切酶酶切后，连接，转化大肠杆菌TOP 10，在长出菌落后，随机挑取做菌落PCR，可以扩出和目的基因一样大小的条带，选取可以扩出目的带的菌落（在做菌落PCR时已经做相应的划线培养），提取质粒后，做单酶切后竟然是是空载体的大小，当然了，双酶切也没有切出750bp大小的条带。
       请教大虾指点，这是什么原因？如何解决？
       谢谢您的帮助！
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游离在生存的边缘上，踯躅在科学的门外，溺死在知识的海洋中，转世在报恩的篱下。
1楼 2008-11-01 16:36:57
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pissor

木虫 (正式写手)
只要虫友能分析出原因或者给出解决方法，均可获得金币！

若您提出的解决方法经过我的实验验证有效，您将获得最多的金币！

有效期至直至验证正确！
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游离在生存的边缘上，踯躅在科学的门外，溺死在知识的海洋中，转世在报恩的篱下。
2楼2008-11-01 16:49:42
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lifei-fei

金虫 (著名写手)

伊丽莎白
恩，实验室的人也出现过这种情况，没有连上，只是形成假环，提质粒时就带上了，PCR可以检测出。要连的片段不是按照设计的酶切位点连上去的，是通过其它方式暂时连上去的，形成一种成为假环的东西，是不能酶切的！继续重新构建吧！祝你好运！
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做有意义的事就是好好活着！
3楼2008-11-01 19:06:35
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chjw2010

铁杆木虫 (著名写手)

项目经理
不清楚,替你顶一下
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新的一年!
4楼2008-11-01 19:31:07
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pissor

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lifei-fei at 11/1/08  19:06:
恩，实验室的人也出现过这种情况，没有连上，只是形成假环，提质粒时就带上了，PCR可以检测出。要连的片段不是按照设计的酶切位点连上去的，是通过其它方式暂时连上去的，形成一种成为假环的东西，是不能酶切的！ ...

继续从头做？没有其他的办法吗？你们实验室是怎么最终构建好表达载体的？靠次数、凭概率？
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游离在生存的边缘上，踯躅在科学的门外，溺死在知识的海洋中，转世在报恩的篱下。
5楼2008-11-01 19:39:30
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shenye.judy

木虫 (正式写手)
连接载体与目的片段的比列可以调整下试试。
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6楼2008-11-02 09:39:27
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pissor

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by shenye.judy at 11/2/08  09:39:
连接载体与目的片段的比列可以调整下试试。

空载体应该不能环化，不能环化，就不能行使功能，所以抗性培养板上应该长不出来，除非是没且没有切开的载体才可以吧。
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游离在生存的边缘上，踯躅在科学的门外，溺死在知识的海洋中，转世在报恩的篱下。
7楼2008-11-02 14:02:54
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cdl007

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
pissor(金币+5,VIP+0):很有道理，十分感谢你！
呵呵，这个很多人都碰到过，原因就是连接转化时有一些DNA片段（750bp）沾在细菌表面随细菌一起培养，如果你做菌落pcr，模板是这些片段，所以你能P出来，
过夜摇菌培养后，你再做菌液pcr恐怕就P不出来了，因为这时候菌上的DNA片段摇落培养基里或者降解了。
而真正转进去的是没有连接好的，你提质粒啥的也是阴性结果了，
这个原因也是俺琢磨了好久才明白
这种假阳性很常见，所以一般菌落PCR不太妥当，至少要菌液摇摇再P出结果才有希望

呵呵，给金币哦？
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8楼2008-11-02 16:09:29
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cdl007

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
pissor(金币+5,VIP+0):再次感谢你的热心帮助，“以儆效尤”！
总归是你没有连上，问题出在连接的步骤，小片段和质粒的比例要再调整，或者连接时间长一些，主要这是个几率问题，如果你不考虑连接率或转化率而只要转进去就行，那不妨放大体系，多涂些平板，总能有几个阳性克隆的。比如原来你做4块平皿，不如多做10几块，

[ Last edited by cdl007 on 2008-11-2 at 16:14 ]
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9楼2008-11-02 16:13:51
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pissor

木虫 (正式写手)
我不暂做试验了，直接送去测序了。谢谢各位虫友的支持！“活动到此结束”，也谢谢版主！
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游离在生存的边缘上，踯躅在科学的门外，溺死在知识的海洋中，转世在报恩的篱下。
10楼2008-11-03 19:26:31
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