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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » Sephadex G-50纯化问题，求指点
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Anastasiav

新虫 (小有名气)

[交流] Sephadex G-50纯化问题，求指点 已有3人参与

背景：GE公司的Sephadex G-50填料装柱（柱体积约为700ml），上样13ml（c大约为11mg/ml），洗脱流速为450ul/min。
问题：G-50分离性能500-30000d，我需要分离28300d和17000d的两种蛋白，结果是大分子贯穿洗脱全程，小分子在中间洗脱出来，但都不是尖锐的峰，与预测不符合，自己又分析不出，之前做小样洗脱，流速130ul/min，也是同样的状况。
求大神们指点指点
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1楼 2016-05-20 12:26:14
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hc-material

专家顾问 (职业作家)
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建议你试一下G-75
或者试下其他层析，分子量相差并不大，不建议你使用分子筛。可以离子，或疏水。祝顺利
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2楼2016-05-20 16:41:59
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Anastasiav

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hc-material at 2016-05-20 16:41:59
建议你试一下G-75
或者试下其他层析，分子量相差并不大，不建议你使用分子筛。可以离子，或疏水。祝顺利

首先经过离子柱层析之后，并未完全分离开，想进一步纯化，因此考虑分子筛。查阅文献是用分子筛即可分离开，这个方法不可行吗？
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3楼2016-06-02 10:26:05
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麦子果树

新虫 (小有名气)
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柱体积700ml，请问一下，你的柱子是什么规格的？
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4楼2016-06-04 12:51:50
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Anastasiav

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 麦子果树 at 2016-06-04 12:51:50
柱体积700ml，请问一下，你的柱子是什么规格的？

高一米左右的细长柱子

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5楼2016-06-04 18:00:51
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麦子果树

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5楼: Originally posted by Anastasiav at 2016-06-04 18:00:51
高一米左右的细长柱子
...

那你的内径大概是14mm的样子，配上1m的柱子，表面积是不是有点小了。你的样品浓度是1.1%，可以适当调小点（<0.5%）再试试。自己做的分子筛柱子，不能够控制压力，感觉流速有点慢。
希望对你有点帮助。
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6楼2016-06-05 11:39:07
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Anastasiav

新虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by 麦子果树 at 2016-06-05 11:39:07
那你的内径大概是14mm的样子，配上1m的柱子，表面积是不是有点小了。你的样品浓度是1.1%，可以适当调小点（<0.5%）再试试。自己做的分子筛柱子，不能够控制压力，感觉流速有点慢。
希望对你有点帮助。...

柱子半径1.75cm 填料高度75cm

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7楼2016-06-06 14:02:09
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麦子果树

新虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by Anastasiav at 2016-06-06 14:02:09
柱子半径1.75cm 填料高度75cm
...

你换了样品浓度试了之后，还是不行吗？ 你可以把你的分子筛拍张照片看看吗？
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8楼2016-06-07 08:31:50
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Anastasiav

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 麦子果树 at 2016-06-07 08:31:50
你换了样品浓度试了之后，还是不行吗？ 你可以把你的分子筛拍张照片看看吗？...

非常感谢您的指导！
    做过极低浓度过柱子，效果不好，后来试过浓缩后也不行，柱子填料装得很均匀，进口GE公司的填料。之前也试过G200国产填料装柱，效果也不好。我在想是不是我的目的蛋白和杂质蛋白都是载脂蛋白，没有经过脱脂处理，两种蛋白分不开。
希望得到进一步的指点！别放弃我~

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9楼2016-06-07 20:07:17
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walking dead

金虫 (小有名气)

填料制备和蛋白纯化专家
★
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所谓凝胶排阻就是排阻和渗透来分开蛋白的。两个蛋白分子量相差10倍以上才推荐凝胶排阻的方法分离。你这个两个蛋白分子量都比30000小，都可以进去微球的孔，所以分离效果差是正常的。如果两个蛋白一个被全排阻也就是不进去孔（大于30000），直接外体积下来，另个进去孔，这样还好些。你这样肯定不行。你可以找找两个蛋白其他特性，比如等电点，疏水强弱，有没有可以特异性结合的基团什么的。换一种纯化思路试试。祝你万事顺利。
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10楼2016-06-23 15:36:32
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