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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 绝对定量PCR标准曲线绘制问题
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六界玄灵

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 绝对定量PCR标准曲线绘制问题 已有1人参与

刚开始做功能基因的绝对定量，目的基因确定导入质粒中，也经过普通PCR验证过，扩增没有杂带，扩增曲线还可以，但是熔解曲线不知道是什么情况，后期做的一次扩增曲线比上图还要好，熔解曲线前一部分没有任何杂峰，最后出现的峰图不知道什么意思，请大神不吝赐教！谢谢啦

绝对定量PCR标准曲线绘制问题
捕获1.PNG


绝对定量PCR标准曲线绘制问题-1
捕获.PNG@biostar2009@飞约疯人院@wizardfan@youlinglyw
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1楼 2016-05-18 22:32:51
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qx4117

银虫 (小有名气)
楼主的扩增曲线很漂亮，不知道楼主做的是不是DNA的绝对定量？我也做功能基因的定量，但是梯度稀释的质粒，Ct值都很接近啊，想问一下楼主质粒浓度是多少，稀释的梯度又是多少，不胜感激。
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2楼2018-01-03 15:47:00
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Jianxiao_H

金虫 (正式写手)
你扩增子多大？
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多少辛酸不可告人。
3楼2018-01-04 00:41:17
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宇宙小妖怪

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

溶解曲线出现双峰表示扩增特异性不好，可能是引物设计存在问题我觉得一般引物设计时特异性没有问题，只是理论，关键要看实践。我觉得你可以尝试提高退火温度，但是这样可能会导致CT值略晚出现，我师姐他们实验室用BIOGHC ELITEFAST SYBR KIT扩增GAPDH基因的一个片段，他们当时也出现了溶解曲线有双峰，通过提高退火温度来调整优化实验条件
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4楼2019-03-25 13:41:04
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