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六界玄灵

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 绝对定量PCR标准曲线绘制问题 已有1人参与

刚开始做功能基因的绝对定量,目的基因确定导入质粒中,也经过普通PCR验证过,扩增没有杂带,扩增曲线还可以,但是熔解曲线不知道是什么情况,后期做的一次扩增曲线比上图还要好,熔解曲线前一部分没有任何杂峰,最后出现的峰图不知道什么意思,请大神不吝赐教!谢谢啦

绝对定量PCR标准曲线绘制问题
捕获1.PNG


绝对定量PCR标准曲线绘制问题-1
捕获.PNG@biostar2009@飞约疯人院@wizardfan@youlinglyw
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qx4117

银虫 (小有名气)

楼主的扩增曲线很漂亮,不知道楼主做的是不是DNA的绝对定量?我也做功能基因的定量,但是梯度稀释的质粒,Ct值都很接近啊,想问一下楼主质粒浓度是多少,稀释的梯度又是多少,不胜感激。
2楼2018-01-03 15:47:00
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Jianxiao_H

金虫 (正式写手)

你扩增子多大?
多少辛酸不可告人。
3楼2018-01-04 00:41:17
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宇宙小妖怪

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

溶解曲线出现双峰表示扩增特异性不好,可能是引物设计存在问题我觉得一般引物设计时特异性没有问题,只是理论,关键要看实践。我觉得你可以尝试提高退火温度,但是这样可能会导致CT值略晚出现,我师姐他们实验室用BIOGHC ELITEFAST SYBR KIT扩增GAPDH基因的一个片段,他们当时也出现了溶解曲线有双峰,通过提高退火温度来调整优化实验条件
4楼2019-03-25 13:41:04
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