24小时热门版块排行榜    

查看: 5989  |  回复: 3
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

六界玄灵

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 绝对定量PCR标准曲线绘制问题 已有1人参与

刚开始做功能基因的绝对定量,目的基因确定导入质粒中,也经过普通PCR验证过,扩增没有杂带,扩增曲线还可以,但是熔解曲线不知道是什么情况,后期做的一次扩增曲线比上图还要好,熔解曲线前一部分没有任何杂峰,最后出现的峰图不知道什么意思,请大神不吝赐教!谢谢啦

绝对定量PCR标准曲线绘制问题
捕获1.PNG


绝对定量PCR标准曲线绘制问题-1
捕获.PNG@biostar2009@飞约疯人院@wizardfan@youlinglyw
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

宇宙小妖怪

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

溶解曲线出现双峰表示扩增特异性不好,可能是引物设计存在问题我觉得一般引物设计时特异性没有问题,只是理论,关键要看实践。我觉得你可以尝试提高退火温度,但是这样可能会导致CT值略晚出现,我师姐他们实验室用BIOGHC ELITEFAST SYBR KIT扩增GAPDH基因的一个片段,他们当时也出现了溶解曲线有双峰,通过提高退火温度来调整优化实验条件
4楼2019-03-25 13:41:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 4 个回答

qx4117

银虫 (小有名气)

楼主的扩增曲线很漂亮,不知道楼主做的是不是DNA的绝对定量?我也做功能基因的定量,但是梯度稀释的质粒,Ct值都很接近啊,想问一下楼主质粒浓度是多少,稀释的梯度又是多少,不胜感激。
2楼2018-01-03 15:47:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
信息提示
请填处理意见