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e生物圈

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[交流] Southern blot技术资料分享

原理介绍：
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的方法。其原理为利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或紫外线照射固定，再与相对应结构的DIG标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。

研究用途：
遗传病诊断
DNA图谱分析
检测样品中的DNA及其含量
PCR产物分析

实验流程：
DNA提取-------引物设计------DNA检测------探针制备-------探针标记 -----标记探针检测

实验步骤：
一、基因组DNA的制备
二、基因组DNA的限制酶切
   根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA浓度不宜太高，以0.5μg /μl 为好。具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入
DNA（1μg /μl）                   20 μg
10×酶切buffer                      4.0 μl
限制性内切酶（10U/μl）       5.0 μl
加ddH2O至500 μl
在最适温度下消化1-3hour。消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。若消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hour已没有必要。或者放大反应体积，或者补充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活力下降。
消化后的DNA加入1/10 体积的0.5M EDTA，以终止消化。然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提，2.5倍体积乙醇沉淀，少量TE溶解。
如果需要两种酶消化DNA，而两种酶的反应条件可以一致，则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致，则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度，再加第二种酶进行消化。
三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法，制备简单，分离范围广（200bp-50kb），实验成本低。下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DNA片段范围。

琼脂糖凝胶浓度（%）分离DNA片段范围（kb）表：不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围
      0.3                                                                   5-60
      0.6                                                                   1-20
      0.7                                                                   0.8-10
      0.9                                                                   0.5-7
      1.2                                                                   0.4-6
      1.5                                                                   0.2-3
      2.0                                                             0.1-2
1. 制备0.8%凝胶：一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。
2.  电泳：电泳样品中加入6×Loading 缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加DNA Marker。1-2V/cm，DNA从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时，停止电泳。取出凝胶，紫外灯下观察电泳效果。在胶的一边放置一把刻度尺，拍摄照片。正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带，照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置，以确定被杂交的DNA长度。
四、转膜
转膜就是将琼脂糖凝胶中的DNA 转移到硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜上，形成固相DNA。转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交。转膜时可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。。常用的转移方法有盐桥法、真空法和电转移法。
五、探针标记
进行Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。而探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，有一些试剂盒可供选择，操作也很简单。
例：
1. 取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中，100℃变性5min，立即置冰浴。
2. 在另一个0.5ml离心管中加入：
Labeling 5×buffer （含有随机引物）                                        10μl
dNTPmix  (含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM)                            2μl
BSA（小牛血清白蛋白）                                                             2μl
[a-32P]dATP                                                                               3μl
Klenow酶                                                                                     5U
3. 将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl，混匀。室温或37℃ 1hr。
4. 加50μl 终止缓冲液终止反应。
标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。
六、杂交
Southern 杂交一般采取的是液-固杂交方式，即探针为液相，被杂交DNA为固相。杂交发生于一定条件的溶液（杂交液）中并需要一定的温度，可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断的在膜上流动。杂交液可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。下面给出的为一杂交液配方：
PEG 6000 10%；SDS 0.5%；6×SSC；50%甲酰胺。该杂交液的杂交温度为42℃。
1. 预杂交
NC膜浸入2×SSC中5min，在杂交瓶中加入杂交液（8cm×8 cm的膜加5ml即可），将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液。放入42℃杂交炉中，使杂交体系升到42℃。取经超声粉碎的鲑鱼精DNA（已溶解在水或TE中）100℃加热变性5min，迅速加到杂交瓶中，使其浓度达到100μg/ml。继续杂交4hour。鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点，降低杂交背景、提高杂交特异性。
2. 杂交
倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至42℃的杂交液，同样加入变性的鲑鱼精DNA。将探针100℃加热5min，使其变性，迅速加到杂交瓶中。42℃杂交过夜。
七、洗膜与检测
取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜：
2×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
1×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.5×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.2×SSC/0.1% SDS，56℃，10min；
0.1×SSC/0.1% SDS，56℃，10min。
在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水份，并用保鲜膜包裹，注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。将膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏），在暗室的红光下，贴覆两张X光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒，置-70℃低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天时间。洗片时，先洗一张X光片，若感光偏弱，则再多加两天曝光时间，再洗第二张片子。
影响Southern杂交实验的因素很多，主要有：DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。

作为Southern blot实验技术的交流贴哈，大家还有其他方面的知识可以继续补充。

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