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荧光定量PCR，溶解曲线出现双峰已有4人参与
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在做质粒标准曲线时，看溶解曲线的效果挺好的，是单一的峰，如图1所示，但当做环境样品时，溶解曲线取出现双峰，如图2所示，请问这是问什么？是我的引物不好，还是模板的问题？ 1.png  2.png |
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【答案】应助回帖
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你这种情况就是一对引物扩出了两种产物，这两种产物可能是目的序列出现多态性，如果是DNA样品，在杂交品种中极有可能出现，如果是cDNA样品，也有可能出现，这两种情况我都遇到过，所谓HRM对DNA分型就是用的这个原理；这两种产物也可能是其一是非特异性扩增，大小差异不大，一般的PCR分不开，但是GC含量不一样，溶解曲线很容易就分开了。 无论是哪种情况，将PCR产物测序就知道了，多测几个样，我就干过。 等等，你可能会说你的质粒只有一个峰，那必须的，你质粒上只是克隆了其中一种产物，是单克隆，自然只有一个峰，你没发现你质粒的峰和双峰的第二个峰是一致的吗，那么第一个峰就是多出来的另一种产物。 再等等，你的引物确实有问题，你没发现72℃左右还有一个峰吗？虽然质粒做模板特异性高，还是有峰的存在，所以你的质粒样品也不是单峰，而且环境样品该峰就凸显出来了，建议减少引物量或者重新设计引物。 |
16楼2016-06-13 17:57:51
wangranjun
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广庭之惘然
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2楼2016-05-12 22:12:23
3楼2016-05-12 23:03:26
nealandmoz
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4楼2016-05-13 00:37:12