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AWANGJIACUO

新虫 (初入文坛)

[求助] 16s rDNA菌种鉴定TA克隆后非空载条带大小却不对 已有1人参与

各位虫友，本人最近在做一份16s rDNA菌种鉴定，是肠道微生物提取的DNA，经27F和1492R扩增条带很亮，回收后直接测序峰图显示模板不纯，故做TA克隆，转化涂板后做菌落PCR显示大部分为阳性克隆，条带大小约1500bp，然后提取相应质粒进行测序，问题出现了：正向M13-47测出几乎都是载体序列，反向M13-48所测结果却非载体序列且可以找到27F引物序列，这是什么原因造成的，是PCR产物降解了吗，但菌落PCR条带大小却又是正确的？
哪位虫友有想法 ，帮帮忙，多谢多谢哦！
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好好活吧，因为我们会死很久。。。
1楼 2016-05-11 08:39:17
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守望海贝

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌落PCR会出现假阳性，看你测序结果几乎是载体序列，可能是因为T载体上有与你的引物配对的序列，你PCR鉴定的是载体上扩出来的序列。若你从样本中扩增出来条带了，可以直接寄给测序公司测序，他们会帮你做胶回收纯化，测序的，不需要你自己纯化。前提是你没有非特异性扩增
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2楼2016-05-11 09:28:46
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AWANGJIACUO

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 守望海贝 at 2016-05-11 09:28:46
菌落PCR会出现假阳性，看你测序结果几乎是载体序列，可能是因为T载体上有与你的引物配对的序列，你PCR鉴定的是载体上扩出来的序列。若你从样本中扩增出来条带了，可以直接寄给测序公司测序，他们会帮你做胶回收纯化 ...

嗯嗯 谢谢  不过正是由于测序结果显示模板不纯  才做了TA克隆出现了后面的问题
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好好活吧，因为我们会死很久。。。
3楼2016-05-11 10:11:13
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AWANGJIACUO

新虫 (初入文坛)
又重新反复比对了几次，发现正向和反向都在大约48bp的地方开始是27F的序列，重新挑菌以27F和1492R做菌p验证，仍旧如此，啊~~~怎么办，究竟是什么原因造成的呢，百思不得其解，哪位快来帮帮忙！！
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好好活吧，因为我们会死很久。。。
4楼2016-05-13 11:35:45
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