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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于大肠杆菌破壁问题,蛋白电泳,上清中没有目的条带 求解

本人最近构建了,植酸酶的重组菌株,载体为pET28a,表达菌株是BL21(de3)


问题是诱导表达后的菌株,全细胞跑蛋白电泳有目的条带,但是细胞破碎后,上清中没有目的条带,沉淀中有。


先问下是什么原因,是没有破开还是形成包涵体了?


IPTG诱导浓度为1mM,od 2,诱导24h,请大神解答,谢谢了

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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by hc-material at 2016-05-12 09:31:36
没破开和形成包涵体的可能都有可能,你怎么破碎的也没说啊。形成包涵体的可能性更大一些。若包涵体,可以尝试低温诱导,比如25度,20度等。
没破开就重新找破开的条件。
后续若纯化,还是先尝试可溶性表达吧,若不 ...

谢谢了,是包涵体。通过改变条件有一部分的可溶性的蛋白。

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10楼2016-06-15 18:45:49
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)

还有如果是包涵体,应该怎么解决?

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2楼2016-05-08 21:32:24
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)


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上清中有e coli其他蛋白的带吧? 如果那样应该就是你的蛋白在包涵体。

可以尝试降低诱导温度,降iptg浓度。 另外你诱导时菌浓应该过了。。。
3楼2016-05-09 09:49:32
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守望海贝

捐助贵宾 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
加诱导剂时,菌液OD600的值应该是0.6左右,你的诱导时间有点长哇,我一般诱导4-5h。如果这样子表达的蛋白还是在沉淀里,应该就是包涵体表达了,那就只能将包涵体蛋白变性、复性后再纯化
4楼2016-05-09 14:11:51
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