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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 关于大肠杆菌破壁问题，蛋白电泳，上清中没有目的条带 求解
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于大肠杆菌破壁问题，蛋白电泳，上清中没有目的条带 求解

本人最近构建了，植酸酶的重组菌株，载体为pET28a，表达菌株是BL21（de3）


问题是诱导表达后的菌株，全细胞跑蛋白电泳有目的条带，但是细胞破碎后，上清中没有目的条带，沉淀中有。


先问下是什么原因，是没有破开还是形成包涵体了？


IPTG诱导浓度为1mM，od 2，诱导24h，请大神解答，谢谢了

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1楼 2016-05-08 21:31:50
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
还有如果是包涵体，应该怎么解决？

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2楼2016-05-08 21:32:24
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)
★
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上清中有e coli其他蛋白的带吧？ 如果那样应该就是你的蛋白在包涵体。

可以尝试降低诱导温度，降iptg浓度。 另外你诱导时菌浓应该过了。。。
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3楼2016-05-09 09:49:32
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守望海贝

捐助贵宾 (小有名气)
★
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加诱导剂时，菌液OD600的值应该是0.6左右，你的诱导时间有点长哇，我一般诱导4-5h。如果这样子表达的蛋白还是在沉淀里，应该就是包涵体表达了，那就只能将包涵体蛋白变性、复性后再纯化
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4楼2016-05-09 14:11:51
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wochong

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
估计是形成包涵体了，包涵体你先跑一下看是否有结果，包涵体要先变性在复性，操作比较困难，或结果不一定是好的，具体的包涵体复性步骤及实验FAQ，可以访问：http://www.detaibio.com/topics/inclusion-body-refolding-introduction.html
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5楼2016-05-09 17:53:11
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hc-material

专家顾问 (职业作家)
★
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没破开和形成包涵体的可能都有可能，你怎么破碎的也没说啊。形成包涵体的可能性更大一些。若包涵体，可以尝试低温诱导，比如25度，20度等。
没破开就重新找破开的条件。
后续若纯化，还是先尝试可溶性表达吧，若不行，就纯化包涵体呗，只是包涵体纯化起来比较麻烦，然后一般收率会比较低
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6楼2016-05-12 09:31:36
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小郭tongxue

铁虫 (小有名气)
★
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包涵体的可能性大些，我们平时都是OD到0.6就加入诱导剂，0.1-1 mM，一般16度过夜诱导，如果是包涵体，可以选择换载体，pGEX-2T，可溶性明显曾加，也可以换宿主Origami（DE3）系列可以提高可溶性表达；如果是未破完全，你可以继续破碎，破碎结束后镜检，就好
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7楼2016-05-25 10:02:20
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xuweitao at 2016-05-09 09:49:32
上清中有e coli其他蛋白的带吧？ 如果那样应该就是你的蛋白在包涵体。

可以尝试降低诱导温度，降iptg浓度。 另外你诱导时菌浓应该过了。。。

谢谢了，温度降低16℃，iptg降低到了0.025M。效果好多了

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8楼2016-06-15 18:44:29
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 守望海贝 at 2016-05-09 14:11:51
加诱导剂时，菌液OD600的值应该是0.6左右，你的诱导时间有点长哇，我一般诱导4-5h。如果这样子表达的蛋白还是在沉淀里，应该就是包涵体表达了，那就只能将包涵体蛋白变性、复性后再纯化

谢谢了

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9楼2016-06-15 18:44:54
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hc-material at 2016-05-12 09:31:36
没破开和形成包涵体的可能都有可能，你怎么破碎的也没说啊。形成包涵体的可能性更大一些。若包涵体，可以尝试低温诱导，比如25度，20度等。
没破开就重新找破开的条件。
后续若纯化，还是先尝试可溶性表达吧，若不 ...

谢谢了，是包涵体。通过改变条件有一部分的可溶性的蛋白。

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10楼2016-06-15 18:45:49
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