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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » qPCR问题求教高手
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mirenox

铁虫 (小有名气)

[求助] qPCR问题求教高手

大神们好，本人在做qPCR遇到一个非常头疼的问题。我们想做在药物处理条件下某个抑癌基因的转录水平分析。
因为药物处理后该抑癌基因蛋白水平发生了变化。我们想知道是在蛋白水平调控还是在转录水平调控。但做qPCR时，实验组和对照组抑癌基因Ct值都大于37，此时GAPDH Ct值为18左右。
Ct值太大据说可以认为表达水平很低，请问我该怎么办。把模板量加大还有意义吗？是不是可以直接做转录后水平调控？或者大神们有没有更好的办法。

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1楼 2016-05-05 23:19:29
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
个人认为Ct值大于37的比较没有意义，因为稍微出现1个Ct值的差异也基本是误差。
不确定这个GAPDH是否属于高表达性内参，如果是，选择低表达性内参，加大样品量，单个基因丰度扩大100倍基本等同于6.4个Ct值。但是各人非常怀疑这种做法是否具有有效性，因为从RNA提取到反转录的过程中，这种加大样品量的做法回旋余地很小。

我真正的看法是：在药物处理过程中，效应量都应该基本具有显著结果（个人看法），如果你已知某个药物确实影响某个基因的表达，但是该基因上下调的幅度只有1.5倍左右。那么可以反推，这个药物的处理也就没有那么显著（除非这个基因已被证明上下调1.5被就能有显著的表型出现），也其实说明这种研究基本没有价值（有点武断），所以你的实验来看，直接去做蛋白水平吧，需要补全结果的时候，扔张半定量的胶图都比定量要好。

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Let God do with it as He wills
2楼2016-05-06 00:38:00
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mirenox

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2016-05-06 00:38:00
个人认为Ct值大于37的比较没有意义，因为稍微出现1个Ct值的差异也基本是误差。
不确定这个GAPDH是否属于高表达性内参，如果是，选择低表达性内参，加大样品量，单个基因丰度扩大100倍基本等同于6.4个Ct值。但是各人 ...

你好，非常感谢。你的意思是需要补全数据时放一张半定量胶图。我对这个半定量可能不太理解。这半定量胶图是指用qPCR的产物跑个胶还是用普通PCR的产物跑胶啊。你的回答对我非常重要。

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3楼2016-05-06 19:02:40
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
3楼: Originally posted by mirenox at 2016-05-06 19:02:40
你好，非常感谢。你的意思是需要补全数据时放一张半定量胶图。我对这个半定量可能不太理解。这半定量胶图是指用qPCR的产物跑个胶还是用普通PCR的产物跑胶啊。你的回答对我非常重要。
...

半定量即终点定量法，说俗了就是PCR完了直接跑胶，看亮度进行灰度分析。你把定量的产物直接跑胶看亮度来决定基因表达差异也称之为半定量。但没有人这么做，原因在于定量引物为保证特异性通常设计的扩增范围都较短，大约70~150bp左右，而这种长度的产物跑胶基本是很暗且部分弥散的。所以普通的半定量要求设计300~500bp左右的扩增区间，PCR后直接跑胶观察亮度以决定基因表达的变化。
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Let God do with it as He wills
4楼2016-05-07 02:18:28
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