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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 基因敲除实验，急需帮助，谢谢啦！
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鱼虾水中游

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因敲除实验，急需帮助，谢谢啦！

我已经做基因敲除试验半年了，利用质粒pUC19构建用于基因敲除的自杀质粒，抗生素抗性基因为cm，构建好重组质粒，然后进行电转，以获得同源重组菌，重复了多次，每次都能长出几个菌落，但敲除后挑单菌落摇菌用PCR扩增，能扩增出cm片段和目的片段，但是缺失片段也能扩增出，传代几次PCR结果与之相似，而且做Western blot也能检测到目的蛋白，难道cm基因插入非目标片段处，没有同源重组掉吗？请问导致这种情况的原因是啥？如何解决？非常感谢!

[ Last edited by 鱼虾水中游 on 2016-4-27 at 17:25 ]@biostar2009
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1楼 2016-04-25 16:30:25
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yushin_young

新虫 (初入文坛)
能留个联系方式吗？虽然感觉你可能已经毕业了。。

我也是做的插入缺失，也遇到了同样的问题，我觉得，你扩出目的条带的原因多半是因为，在抗性的培养基中缺失株不断发生第二次交换，导致其失去抗性，所以在培养基中出现了许多死菌，所以跑PCR会跑出这样的结果，理论上应该提RNA进行反转录，这样做出来的结果更靠谱一些。
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2楼2017-06-02 10:14:35
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18240090216

新虫 (初入文坛)
你好 ，想问一下这个问题解决了么？如果解决请告知，我也遇到同样的问题，亟待解决。
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3楼2018-03-28 13:55:18
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