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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切后连接，一直失败
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荷岚102

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切后连接，一直失败 已有3人参与

1.质粒上有两个相邻的酶切位点，分别是EcoR1、EcoRV，那么这两个位点可以切的开吗？我双酶切了一周，一直没有切开。
2.T载体上已经连接了一个400bp的片段A，片段A两端分别有EcoRV和Hind3，构建为A—T，现在用 EcoRV和 EcoR1双酶切A—T(两个酶切位点间隔31bp)，然后再连接600bp左右的片段B，可是转化后菌液PCR一直克隆的是A—T上的片段，感觉好像没有连上B。
我重复了很多次，每次的转化子都是这样的情况，希望大神们给予帮助

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1楼 2016-04-24 22:25:50
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Eternity宇

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
2楼2016-04-25 07:45:23
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菜头Q

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
会不会是发生了重组抑制或者是因为两种酶在空间上形成了抑制？建议你对载体进行酶切位点分析，然后在酶切的时候先用EcoR V消化一个小时后，再加入EcoR I继续消化。
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3楼2016-04-25 11:12:02
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原海亮

木虫 (著名写手)
ECORV好像是平末端吧，连接效率不如粘性末端，如果可以建议更换

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
4楼2016-04-26 08:31:48
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daiyuccc

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
两个酶切位点隔得太近确实不利于切开，建议一个一个酶的切，也可以测测你的 位点有没有问题
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5楼2016-04-26 11:00:09
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荷岚102

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by daiyuccc at 2016-04-26 11:00:09
两个酶切位点隔得太近确实不利于切开，建议一个一个酶的切，也可以测测你的 位点有没有问题

测位点有没有问题？不是太懂

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6楼2016-04-26 12:31:04
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娟恋幸福

新虫 (小有名气)
我也遇到同样的情况好久了，快郁闷死了

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7楼2016-04-26 23:47:07
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nanxiao13

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
8楼2016-04-27 02:06:40
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玉兔Jane

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1、保护碱基是否合适？一般都还好吧。
2、酶切是否切开了？连接是否连上了？如果有别的载体也是酶切连接，可以一起做啊，如果成功了可以说明操作很好吧。  没有用过EcoRV，抱歉。
3、实在不行，可以考虑下同源重组的方法吗？
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9楼2016-04-27 23:17:04
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你太善良

新虫 (著名写手)
相临？隔了几个碱基？如果没有隔真的不好切，酶也要空间的

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10楼2016-04-29 12:24:24
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