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glove94

木虫 (小有名气)

[求助] 普通pcr条带不清楚,求助 已有1人参与

目前在做普通pcr,但是条带不清楚,浓度太低,没有办法测序。
20ul体系所用试剂:
mix 10ul
水 7ul
上下游引物各1ul
DNA模板1ul (浓度大约300ng)
ps:之前可以跑出很亮条带的,只有最后3个样出不来,一共46个样,其他43个测序很成功。
电泳:1.5%的胶,120V,20分钟
marker:Takara DL2000
mix:Takara
pcr程序:
98度30s
98度30s
梯度30s
72度1min
72度7min
4度保存
循环次数34

普通pcr条带不清楚,求助


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andreai

新虫 (小有名气)

个人觉得模板量有点多了,控制在30ng比较好。还有克隆不出来可以适当降低退火温度

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2楼2016-04-21 05:23:44
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glove94

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by andreai at 2016-04-21 05:23:44
个人觉得模板量有点多了,控制在30ng比较好。还有克隆不出来可以适当降低退火温度

之前用50ng,20ng都跑过,完全看不到条带,温度梯度也扩大了范围,没有什么效果

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3楼2016-04-21 09:12:45
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yvonne9044

新虫 (正式写手)

4楼2016-04-21 10:03:17
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可能是你的片段拷贝数低,利用二次PCR方法,将第一次产物稀释十倍或直接取1ul做模板。
5楼2016-04-21 15:12:03
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glove94

木虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-04-21 15:12:03
可能是你的片段拷贝数低,利用二次PCR方法,将第一次产物稀释十倍或直接取1ul做模板。

稀释十倍试过,条带还没有现在清楚。那我直接取1ul试试好了,谢谢

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6楼2016-04-22 02:33:04
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