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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 普通pcr条带不清楚，求助
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glove94

木虫 (小有名气)

[求助] 普通pcr条带不清楚，求助 已有1人参与

目前在做普通pcr，但是条带不清楚，浓度太低，没有办法测序。
20ul体系所用试剂：
mix 10ul
水 7ul
上下游引物各1ul
DNA模板1ul (浓度大约300ng)
ps：之前可以跑出很亮条带的，只有最后3个样出不来，一共46个样，其他43个测序很成功。
电泳：1.5%的胶，120V，20分钟
marker：Takara DL2000
mix：Takara
pcr程序：
98度30s
98度30s
梯度30s
72度1min
72度7min
4度保存
循环次数34

普通pcr条带不清楚，求助


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1楼 2016-04-20 23:50:29
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andreai

新虫 (小有名气)
个人觉得模板量有点多了，控制在30ng比较好。还有克隆不出来可以适当降低退火温度

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2楼2016-04-21 05:23:44
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glove94

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by andreai at 2016-04-21 05:23:44
个人觉得模板量有点多了，控制在30ng比较好。还有克隆不出来可以适当降低退火温度

之前用50ng，20ng都跑过，完全看不到条带，温度梯度也扩大了范围，没有什么效果

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3楼2016-04-21 09:12:45
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yvonne9044

新虫 (正式写手)
胶回收，稀释，二次pcr

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4楼2016-04-21 10:03:17
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是你的片段拷贝数低，利用二次PCR方法，将第一次产物稀释十倍或直接取1ul做模板。
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5楼2016-04-21 15:12:03
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glove94

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-04-21 15:12:03
可能是你的片段拷贝数低，利用二次PCR方法，将第一次产物稀释十倍或直接取1ul做模板。

稀释十倍试过，条带还没有现在清楚。那我直接取1ul试试好了，谢谢

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6楼2016-04-22 02:33:04
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