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yonghui0539金虫 (初入文坛)
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gateway -LR反应，请知道的帮忙 已有1人参与
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新手在此请教。 我用gateway，LR反应总是不成功，涂板子不长。找不到原因，在此发帖寻求帮助，多些人多些建议，先谢谢各位。 下面是我做得过程： 1. 首先拿到entry clone（这个是一个博后做的，走了）好像是合成的目的片段，然后送到公司他们做得BP反应。我拿到的还有光盘，里面都是PDF文件关于这个entry clone的，所以我觉得应该是没有问题的。我就直接扩增了entry clone，提取了质粒，酶切检测也是对的，我没有测序。 2. 我在实验室管理员那里找到了destination vector，然后也扩增了，挺好的，没有问题，然后提质粒，然后我用酶切检测质粒也是对的（实验室之前都是用这个载体，应该也不会有问题） entry clone 和目的载体都有了，我就直接LR反应了，然后问题也来了。 entry clone（100ng） 1ul destination（100ng） 2ul 酶 1ul TE 1ul 或者 entry clone（30ng） 3ul destination（120ng） 1ul 酶 1ul 反应过夜也没有长菌落，然后我就又调整体系和浓度，也不行。我看有些说明说需要线性化载体，我也酶切了，还是没有成功，做了2个星期。我觉得平板和抗生素都应该没有问题，LR反应的酶也应该没有问题，我做个阳性对照，成功了，虽然长得克隆少点。但是在12h长，最起码长了。 要是有比较好的建议请告诉我，谢谢 |
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