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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » gateway -LR反应，请知道的帮忙
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yonghui0539

金虫 (初入文坛)

[求助] gateway -LR反应，请知道的帮忙 已有1人参与

新手在此请教。
我用gateway，LR反应总是不成功，涂板子不长。找不到原因，在此发帖寻求帮助，多些人多些建议，先谢谢各位。
下面是我做得过程：
1. 首先拿到entry clone（这个是一个博后做的，走了）好像是合成的目的片段，然后送到公司他们做得BP反应。我拿到的还有光盘，里面都是PDF文件关于这个entry clone的，所以我觉得应该是没有问题的。我就直接扩增了entry clone，提取了质粒，酶切检测也是对的，我没有测序。
2. 我在实验室管理员那里找到了destination vector，然后也扩增了，挺好的，没有问题，然后提质粒，然后我用酶切检测质粒也是对的（实验室之前都是用这个载体，应该也不会有问题）
entry clone 和目的载体都有了，我就直接LR反应了，然后问题也来了。
entry clone（100ng） 1ul
destination（100ng） 2ul
酶                            1ul
TE                            1ul
或者
entry clone（30ng）   3ul
destination（120ng） 1ul
酶                             1ul
反应过夜也没有长菌落，然后我就又调整体系和浓度，也不行。我看有些说明说需要线性化载体，我也酶切了，还是没有成功，做了2个星期。我觉得平板和抗生素都应该没有问题，LR反应的酶也应该没有问题，我做个阳性对照，成功了，虽然长得克隆少点。但是在12h长，最起码长了。
要是有比较好的建议请告诉我，谢谢
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1楼 2016-04-16 03:19:12
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sunshine436

新虫 (小有名气)
LR很好做的，不知道你问题出在哪

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2楼2016-04-16 04:10:08
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yonghui0539: 金币+2, ★有帮助 2016-04-18 11:47:59
我做LR反应的时候，一般会把entry 载体线性化，然后胶回收了，再去与destination载体链接，要不会有假阳性。不行你试试。
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3楼2016-04-16 08:26:36
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yonghui0539

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hanxiaominhu at 2016-04-16 08:26:36
我做LR反应的时候，一般会把entry 载体线性化，然后胶回收了，再去与destination载体链接，要不会有假阳性。不行你试试。

谢谢。
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4楼2016-04-18 11:47:35
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芳5992

新虫 (初入文坛)
我的也不长，和你的一样的情况，你解决了吗

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5楼2017-08-21 12:42:39
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芳5992

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hanxiaominhu at 2016-04-16 08:26:36
我做LR反应的时候，一般会把entry 载体线性化，然后胶回收了，再去与destination载体链接，要不会有假阳性。不行你试试。

线性化用什么酶？体系怎么确定呢？

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6楼2017-08-21 12:43:11
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芳5992

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sunshine436 at 2016-04-16 04:10:08
LR很好做的，不知道你问题出在哪

大神，能不能帮帮我，我的lr做了三次了都没出来，着急

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7楼2017-08-21 12:43:39
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 芳5992 at 2017-08-21 12:43:11
线性化用什么酶？体系怎么确定呢？
...

entry载体上一般有一个pva酶切位点，说明书上有，是抗性基因上的。你用的时候确认一下。

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8楼2017-08-22 23:00:22
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 芳5992 at 2017-08-21 12:43:11
线性化用什么酶？体系怎么确定呢？
...

也有可能是pvu，我记不清了。

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9楼2017-08-22 23:01:04
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喃喃自语105

新虫 (初入文坛)
你的问题解决了吗？
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10楼2017-11-08 14:23:25
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