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胡笳桃子

新虫 (小有名气)

[交流] 分步酶切的问题

质粒上的两个酶切位点紧挨,因此采用分步酶切,中间采用试剂盒纯化回收,但转化时发现自连现象严重。
怀疑试剂盒回收方法会回收一些电泳验证时看不到的小片段,于是改用切胶回收。
但将切胶后回收的片段电泳后,发现切胶时的一条亮带在回收后电泳变成了一亮一暗两个条带。

请教:是什么原因?该怎么改进?
希望尽可能用试剂盒回收啊,效率比较高,可是又担心会回收到杂质和其他小片段
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lipishun

金虫 (小有名气)

做克隆吗?
碱性磷酸酶处理酶切后的载体,防止自连!
我一般都用双酶切,没有问题的!
2楼2008-10-23 23:09:58
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ningluztt

铜虫 (小有名气)

建议
1.先验证一下是否真正的实现了双酶切。将单酶切与双酶切的片段电泳检测,跑电泳的时间尽量长一些,胶浓度尽量大一些,如果是双酶切成功应该能看出些微差别。
2另外,用试剂盒回收的时候一半小于50bp的片段是收不上来的,胶回收的效率比直接回收的效率差是肯定的,但回收纯度确是很高,你的胶回收出现两条带,我这里推测一下,你酶切完应该是没有验证酶切效果就直接回收了吧。还是建议酶切完后电泳验证一下,确认酶切成功后再回收
3楼2008-10-24 08:56:39
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yaoyaochong

银虫 (正式写手)

你用的是哪个公司的回收试剂盒,我们实验室之前也出现过,问试剂公司,说是在溶胶以后放到4度冰柜半小时,多余的条带就没了,可能是溶胶液的问题,不影响实验
4楼2008-10-24 11:04:53
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胡笳桃子

新虫 (小有名气)

用的是Takara的,应该不是试剂盒的问题丫。。。。
那可能是我们跑胶的时间不够长吧。。。
赠人玫瑰,手有余香。
5楼2008-10-24 12:10:57
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