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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 分步酶切的问题
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胡笳桃子

新虫 (小有名气)

[交流] 分步酶切的问题

质粒上的两个酶切位点紧挨，因此采用分步酶切，中间采用试剂盒纯化回收，但转化时发现自连现象严重。
怀疑试剂盒回收方法会回收一些电泳验证时看不到的小片段，于是改用切胶回收。
但将切胶后回收的片段电泳后，发现切胶时的一条亮带在回收后电泳变成了一亮一暗两个条带。

请教：是什么原因？该怎么改进？
希望尽可能用试剂盒回收啊，效率比较高，可是又担心会回收到杂质和其他小片段
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1楼 2008-10-23 22:17:01
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lipishun

金虫 (小有名气)
做克隆吗？
碱性磷酸酶处理酶切后的载体，防止自连！
我一般都用双酶切，没有问题的！
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2楼2008-10-23 23:09:58
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ningluztt

铜虫 (小有名气)
建议
1.先验证一下是否真正的实现了双酶切。将单酶切与双酶切的片段电泳检测，跑电泳的时间尽量长一些，胶浓度尽量大一些，如果是双酶切成功应该能看出些微差别。
2另外，用试剂盒回收的时候一半小于50bp的片段是收不上来的，胶回收的效率比直接回收的效率差是肯定的，但回收纯度确是很高，你的胶回收出现两条带，我这里推测一下，你酶切完应该是没有验证酶切效果就直接回收了吧。还是建议酶切完后电泳验证一下，确认酶切成功后再回收
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3楼2008-10-24 08:56:39
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yaoyaochong

银虫 (正式写手)
你用的是哪个公司的回收试剂盒，我们实验室之前也出现过，问试剂公司，说是在溶胶以后放到4度冰柜半小时，多余的条带就没了，可能是溶胶液的问题，不影响实验
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4楼2008-10-24 11:04:53
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胡笳桃子

新虫 (小有名气)
用的是Takara的，应该不是试剂盒的问题丫。。。。
那可能是我们跑胶的时间不够长吧。。。
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5楼2008-10-24 12:10:57
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