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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒求助
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

[求助] 重组质粒求助 已有3人参与

我的目的片段是500左右，用的是pET-32a和pGEX-4T-1两种质粒。分别用双酶切切开后（存放在-20冰箱），酶切位点是EcoR1和BamH1，用T4连接酶过夜连接，可是要不就是不长菌落，要不就是假阳性克隆。     
是没切开？
还是没连上？
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1楼 2016-04-10 15:35:03
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
切没切开不是得跑电泳看看么？然后回收符合要求的条带（切下胶块或者回收产物放-20）再连接呀。
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2楼2016-04-11 08:36:56
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hlxxym

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
请问你在酶切后是否有做切胶回收？如果没有的话，可能是发生了自连。
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3楼2016-04-11 12:45:57
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小研来报到

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶切位点EcoR1和BamH1离得太近了
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4楼2016-04-11 15:22:20
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781055707

木虫 (著名写手)
楼上正解，楼主PET32A的空载质粒能送我些吗?邮费我出，我给你打钱过去。
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采菊东篱下，悠然见南山。
5楼2016-04-11 15:40:21
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hlxxym at 2016-04-11 12:45:57
请问你在酶切后是否有做切胶回收？如果没有的话，可能是发生了自连。

双酶切后，跑胶都有条带，而且都做了切胶回收。
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6楼2016-04-11 21:28:59
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-04-11 08:36:56
切没切开不是得跑电泳看看么？然后回收符合要求的条带（切下胶块或者回收产物放-20）再连接呀。

我用回收纯化的cDNA双酶切，跑电泳有条带，但是不能看出来切开了啊。。
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7楼2016-04-11 21:30:27
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小研来报到 at 2016-04-11 15:22:20
酶切位点EcoR1和BamH1离得太近了

这个离得近影响真的会很大么？我看好多也有用这两个酶切位点的。。
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8楼2016-04-11 21:31:24
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hlxxym at 2016-04-11 12:45:57
请问你在酶切后是否有做切胶回收？如果没有的话，可能是发生了自连。

我现在重新做了一次，酶切之后，就连接了，也不知道结果怎么样
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9楼2016-04-12 14:20:29
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小研来报到 at 2016-04-11 15:22:20
酶切位点EcoR1和BamH1离得太近了

如果，我分两次切可以么？
啊啊啊啊啊啊，难道又要重新换别的酶切位点做了么。。。
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10楼2016-04-12 14:22:02
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