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| 我pcr，现在只能跑出模板，跑过梯度还是跑不出来，为什么啊？模板是没问题的，做过测序了 |
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2楼2008-10-23 15:38:41
shs304
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首先，建议预变性时间再长一点试试看 比如10min 退火温度最好是73→53往下降而不是往上升，退火温度的最低点至少比软件算的Tm再减5度。另外，73度我觉得是没什么意义的，还不如从65甚至60度开始往下降，每降1个循环2~3次，到53（假设是53）在循环多一些 一般来说退火时间30s是足够的，但我试过需要退火40s左右，可能跟我的引物CG比太低有关 buffer是Mg2+ free的？一般来说不用再另外加镁，除非是buffer里头没有。有时候，Mg太高是不利于PCR的，我试过~~会出现一大片smear，错误率也高 酶的话，建议用好一点的酶 反正我用Takara的Ex Taq做不出来的，用Invitrogen的白金高保真Taq就做出来了，不过价格相差五六倍……但实验能做出来也值了 一个50ul体系，一般用1单位酶，20ul的话就按照比例减少。你看看这里的酶会不会不适 一般的Taq的聚合速度是1kb/min，你要扩1300，保险一点最好延伸1.5min。你这里的延伸时间有点短，除非你用的是高速的酶 根据以上几点再试试看能不能做出来 |
5楼2008-10-23 18:52:32