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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » WB遇到的问题
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、悠然浅笑

金虫 (初入文坛)

[交流] WB遇到的问题

实验室构建WB实验，电泳以后，切胶浸泡，甲醇活化PVDF膜，夹板黑色-海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵-夹板顺序，300mA转膜，尝试了三次，转膜时间分别为60min，100min，120min，但是转膜结束后，均为marker转到膜上，蛋白条带未转到膜上，这个怎么破？？？？
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漫漫长路，曾孤身独自走远方，幸得到她跟我流浪
1楼 2016-04-07 08:59:02
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

古月问你哦

铜虫 (小有名气)
★
、悠然浅笑(金币+1): 谢谢参与
不大清楚你是怎么在处理胶，膜，海绵的过程，但有一点要注意的是三者在处理的过程中不要有气泡，我们实验室常用的是电压100V，时间100min，还有你的的一抗的特异性，灵敏性是否纯在问题。
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我就是我，是不一样的烟火
3楼2016-04-07 09:25:18
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黑土茉莉

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你用丽春红染过了？确定蛋白没转过去？还是目的蛋白本来就没有或者很少？

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8楼2016-04-08 08:32:54
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lfkey

木虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
既然Marker能赚到膜上，说明在某种程度上转膜条件还是可以的，至于膜上没有目标蛋白，就需要你对比分析Marker与目标蛋白的大小，依次来调整和摸索电压以及转膜时间；目标蛋白量太少也可能在转膜后难以肉眼看清的，因为转膜过程会造成损失，所以要把握好电压和时间。最后，还是要注意在铺膜和胶时尽量赶走气泡。
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年轻没有失败！
4楼2016-04-07 10:57:00
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、悠然浅笑

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Xllinjy at 2016-04-07 20:56:08
我们是膜在下面，胶在上面，30-35min左右，时间太长会不会有转过的可能啊！

胶应该是靠近黑色夹板的吧？
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漫漫长路，曾孤身独自走远方，幸得到她跟我流浪
11楼2016-04-08 08:38:25
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、悠然浅笑

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 迭芳芳儿 at 2016-04-09 00:54:25
可能是膜孔径大了，而蛋白小，就跑穿尺／去

没有啊  转膜结束后，胶染色上面还有很明显的条带。
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漫漫长路，曾孤身独自走远方，幸得到她跟我流浪
19楼2016-04-11 08:27:02
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普通回帖

zhangzhiguang
★
、悠然浅笑(金币+1): 谢谢参与
2楼2016-04-07 09:17:43
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star013

新虫 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我们能给您做，您需要么？

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5楼2016-04-07 15:04:19
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Xllinjy

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我们是膜在下面，胶在上面，30-35min左右，时间太长会不会有转过的可能啊！
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6楼2016-04-07 20:56:08
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Liumengya

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你是怎么检测蛋白没到膜上呢？

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7楼2016-04-07 22:36:49
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、悠然浅笑

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Liumengya at 2016-04-07 22:36:49
你是怎么检测蛋白没到膜上呢？

转膜过后的胶考马斯亮蓝染色，蛋白条带和平时做电泳差不多；膜化学发光显色后，成像完全木有目的蛋白。。
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漫漫长路，曾孤身独自走远方，幸得到她跟我流浪
9楼2016-04-08 08:37:11
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、悠然浅笑

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Liumengya at 2016-04-07 22:36:49
你是怎么检测蛋白没到膜上呢？

转膜过后的胶考马斯亮蓝染色，蛋白条带和平时做电泳差不多；膜化学发光显色后，成像完全木有目的蛋白。。
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漫漫长路，曾孤身独自走远方，幸得到她跟我流浪
10楼2016-04-08 08:37:43
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