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[交流]
求助：关于质粒构建
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最近在构建质粒，载体中已插入一个目的基因片断（目的基因两端有AatⅡ酶切位点），现想通过控制酶切反应时间得到AatⅡ单切的载体，胶回收、去磷酸化后再与目的片段连接，这样就可以得到含有两个目的基因片段的质粒。但做了几次一直没有转化成功，还请高手指点，具体操作如下： 抽提作为载体的质粒（6ml菌液）80ul双蒸水溶解 酶切 90ul体系： buffer 9ul，0.1%BSA 9ul，AatⅡ 1.5ul，质粒70ul 酶切5min，65度放置10min终止反应，电泳后胶回收目的条带，30ulElution buffer洗脱后去磷酸化，酚氯仿处理后无水乙醇沉淀（因回收到的量较小-20度放置1h 离心25min）看不到沉淀物，70%乙醇洗后直接加12ul的目的基因片段进行连接（20ul体系）。目的片段也为电泳胶回收的 用的是JM109做感受态，氨苄平板 做了好几次都没有菌长出来，不知道此方法是否可行问题到底出在哪里，因为刚接触分子生物学不久还有很多地方不懂，还请各位高手不吝赐教，先在此谢过 |
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xiefl1984 
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