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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：关于质粒构建
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嘉笛

木虫 (小有名气)

[交流] 求助：关于质粒构建

最近在构建质粒，载体中已插入一个目的基因片断（目的基因两端有AatⅡ酶切位点），现想通过控制酶切反应时间得到AatⅡ单切的载体，胶回收、去磷酸化后再与目的片段连接，这样就可以得到含有两个目的基因片段的质粒。但做了几次一直没有转化成功，还请高手指点，具体操作如下：
抽提作为载体的质粒（6ml菌液）80ul双蒸水溶解
   酶切 90ul体系：
buffer 9ul，0.1%BSA 9ul，AatⅡ 1.5ul，质粒70ul  
    酶切5min，65度放置10min终止反应，电泳后胶回收目的条带，30ulElution buffer洗脱后去磷酸化，酚氯仿处理后无水乙醇沉淀（因回收到的量较小-20度放置1h 离心25min）看不到沉淀物，70%乙醇洗后直接加12ul的目的基因片段进行连接（20ul体系）。目的片段也为电泳胶回收的
   用的是JM109做感受态，氨苄平板
      做了好几次都没有菌长出来，不知道此方法是否可行问题到底出在哪里，因为刚接触分子生物学不久还有很多地方不懂，还请各位高手不吝赐教，先在此谢过
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1楼 2008-10-21 08:36:35
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greenspringmi

银虫 (正式写手)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-2 21:41
有两点建议：1、酶切体系一般为20ul，当需要的酶切产物多时，可以增加酶切的管数，不建议扩大体系；
2、Aat II的最适温度是37°，酶切的时间一般为3h；
3、酶切后，建议立即跑胶回收目的条带；
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2楼2008-10-21 08:52:31
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xiefl1984

木虫 (小有名气)
因为不能使之酶切完全，所以要控制时间；
酶切反应体系增大会有什么影响呢？
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3楼2008-10-21 09:02:49
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zhuyeqing8570

铜虫 (小有名气)
我的酶切体系都是20微升，有时候会切的时间长一些，不知道有没有影响
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做本色真实的自己；要么努力，要么放弃
4楼2008-10-23 11:39:39
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amberking

★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-2 21:41
去磷酸化后回收跑电泳了没？如果没跑电泳你怎么知道就回收上了？
酶切我们经常过夜都没太大影响，不过做不出来还是小心点按照说明来吧
还有一般去磷酸化后连接效果的确挺低的，有一次我做只长了一个斑，不过那个就是阳性的，哈哈，希望你也有这个好运气

还有些小小细节，因为你的产物都是回收的，尤其是目的片段还要纯化后回收，你最好确定里面没有残留的70%乙醇，不然再好的酶也会挂

[ Last edited by amberking on 2008-10-23 at 14:41 ]
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5楼2008-10-23 14:37:09
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