| 查看: 439 | 回复: 4 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
| 【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 嘉笛 的 5 个金币 | |||
[交流]
求助：关于质粒构建
|
|||
|
最近在构建质粒，载体中已插入一个目的基因片断（目的基因两端有AatⅡ酶切位点），现想通过控制酶切反应时间得到AatⅡ单切的载体，胶回收、去磷酸化后再与目的片段连接，这样就可以得到含有两个目的基因片段的质粒。但做了几次一直没有转化成功，还请高手指点，具体操作如下： 抽提作为载体的质粒（6ml菌液）80ul双蒸水溶解 酶切 90ul体系： buffer 9ul，0.1%BSA 9ul，AatⅡ 1.5ul，质粒70ul 酶切5min，65度放置10min终止反应，电泳后胶回收目的条带，30ulElution buffer洗脱后去磷酸化，酚氯仿处理后无水乙醇沉淀（因回收到的量较小-20度放置1h 离心25min）看不到沉淀物，70%乙醇洗后直接加12ul的目的基因片段进行连接（20ul体系）。目的片段也为电泳胶回收的 用的是JM109做感受态，氨苄平板 做了好几次都没有菌长出来，不知道此方法是否可行问题到底出在哪里，因为刚接触分子生物学不久还有很多地方不懂，还请各位高手不吝赐教，先在此谢过 |
回复此楼» 猜你喜欢
招收生物学/细胞生物学调剂
已经有4人回复
-
一志愿武汉理工，总分321，英一数二，求老师收留。
已经有5人回复
-
324求调剂
已经有8人回复
-
284求调剂
已经有12人回复
-
348求调剂
已经有3人回复
-
329求调剂
已经有7人回复
-
求调剂，一志愿 南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕
已经有4人回复
-
考研调剂
已经有9人回复
-
304材料求调剂
已经有4人回复
-
一志愿郑大085600，310分求调剂
已经有3人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
2楼2008-10-21 08:52:31
xiefl1984 
木虫 (小有名气)
- 应助: 31 (小学生)
- 金币: 2465.1
- 帖子: 129
- 在线: 26.2小时
- 虫号: 528140
- 注册: 2008-03-18
- 专业: 生物大分子结构与功能
3楼2008-10-21 09:02:49
4楼2008-10-23 11:39:39
5楼2008-10-23 14:37:09
